9 株分離自住院患者的CA-MRSA 基因型菌株的分子特征及耐藥性研究

王院霞，姚鋰?guó)P，鄭巧平，陳 旭

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的重要病原體，可導(dǎo)致皮膚軟組織感染（如癤、癰、手術(shù)傷口感染、創(chuàng)面感染）和侵襲性感染（如骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、膿毒癥）等[1-4]。MRSA 感染于1961 年由英國(guó)首次報(bào)道，后相繼在其他國(guó)家出現(xiàn)，并在全球的醫(yī)院環(huán)境中流行傳播。20 世紀(jì)90 年代起，MRSA 不再局限于醫(yī)院或醫(yī)療環(huán)境中，世界各地相繼報(bào)道了社區(qū)獲得MRSA（community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus,CA-MRSA）感染[5-7]。由此，MRSA 可以分為醫(yī)療機(jī)構(gòu)獲得耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（healthcare-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus，HA-MRSA）和CA-MRSA。HA-MRSA 與CA-MRSA在分子特征、耐藥性及毒力因子等方面均具有一定差異。我國(guó)HA-MRSA 克隆一般攜帶葡萄球菌盒式染色體基因mec （Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）Ⅱ和Ⅲ，而CA-MRSA 一般攜帶SCCmec Ⅳ和Ⅴ。HA-MRSA 通常具有多重耐藥性，而CA-MRSA 一般僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥；CA-MRSA 通常攜帶較多的毒力基因[如殺白細(xì)胞素基因 （panton-valentine leukocidin gene,pvl 基因）]，具有較強(qiáng)的致病性。隨著人群（主要為患者）在醫(yī)院環(huán)境和社區(qū)環(huán)境中的相互流通，CA-MRSA也開始逐漸進(jìn)入醫(yī)院環(huán)境中，并引起相應(yīng)的感染，且隨著CA-MRSA 菌株的進(jìn)化，CA-MRSA 開始對(duì)多種非β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性。本研究收集2014 年4 月至2015 年12 月期間住院患者臨床分離的CA-MRSA 菌株，并對(duì)其進(jìn)行分子特征和耐藥性分析，目前國(guó)內(nèi)尚無類似報(bào)道，為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)CA-MRSA 流行、治療提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

收集2014 年4 月到2015 年12 月期間符合CA-MRSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)的住院患者臨床分離的金黃色葡萄球菌菌株，采用VITEK-2 鑒定系統(tǒng)（生物梅里埃公司，法國(guó)）進(jìn)行鑒定。菌株純化后保存于含30%甘油的肉湯中，置于-80 ℃深低溫冰箱內(nèi)保存。CAMRSA 感染診斷依據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心在2003 年公布的CA-MRSA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體如下。①在門診或入院后48 h 內(nèi)的送檢標(biāo)本中檢測(cè)出MRSA；②患者在過去1 年內(nèi)無住院、無外科手術(shù)、無透析、無人住家庭病房、無使用護(hù)理設(shè)施等；③患者無持續(xù)性留置導(dǎo)管或經(jīng)皮進(jìn)入身體的醫(yī)療裝置。同時(shí)符合以上條件者可診斷為CA-MRSA 感染。

二、方法

1.SCCmec 分型：根據(jù)SCCmec 中ccr 基因復(fù)合物和mec 基因復(fù)合物的不同（見表1），采用PCR 檢測(cè)ccr1-5、mec1 基因（mec 復(fù)合物A）、IS1272-mecR1基因（mec 復(fù)合物B）和IS431-mecA 基因（mec 復(fù)合物C2）。

表1 不同SCCmec 分型的基因結(jié)構(gòu)組成

2.金黃色葡萄球菌A 蛋白（Staphylococcus protein A，SPA）基因分型：擴(kuò)增并測(cè)序spa 基因X區(qū)域的重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)序列的數(shù)目、排列進(jìn)行分型（https://spa.ridom.de/index.shtml）。

3.多位點(diǎn)序列分型 （multilocus-sequence typing，MLST）：檢測(cè)金黃色葡萄球菌7 個(gè)管家基因，與標(biāo)準(zhǔn)序列（http://saureus.mlst.net/）進(jìn)行比對(duì)，得到相應(yīng)的序列號(hào)，根據(jù)不同管家基因序列號(hào)組合得到相應(yīng)的序列型（ST）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并測(cè)序。

4.藥物敏感試驗(yàn)：參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指南，采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)菌株對(duì)青霉素、頭孢西丁、慶大霉素、妥布霉素、紅霉素、克林霉素、磺胺甲唑、利福平、利奈唑胺、莫匹羅星、夫西地酸和替考拉寧等藥物的敏感性；誘導(dǎo)性克林霉素耐藥試驗(yàn)采用D-試驗(yàn)法檢測(cè)，ATCC25923 作為質(zhì)控菌株。

5.耐藥基因和毒力基因檢測(cè)：采用PCR 擴(kuò)增并檢測(cè)mecA 基因、erm(A)、erm(B)、erm(C)基因、pvl基因等[3,8]，擴(kuò)增引物序列見表2。

結(jié) 果

一、CA-MRSA 菌株信息

本研究共收集到147 株分離自住院患者標(biāo)本中的金黃色葡萄球菌菌株，根據(jù)頭孢西丁紙片法和mecA 基因檢測(cè)確認(rèn)，其中共58 株為mecA 基因介導(dǎo)的MRSA 菌株。進(jìn)一步對(duì)這些菌株進(jìn)行SCCmec分型，篩選出SCCmecⅣ型和Ⅴ型的MRSA 菌株（CA-MRSA 基因型菌株）共9 株，其中SCCmecⅣ型3 株，SCCmecⅤ型6 株。

二、MRSA 的分子特征

采用SPA 分型和MLST，對(duì)9 株CA-MRSA 菌株進(jìn)行分析，共檢測(cè)到4 種SPA 型別，即t008（1 株）、t034（1 株）、t127（1 株）和t437（6 株）；ST 型別共5 種，包括ST1（1 株）、ST8（1 株）、ST59（5 株）、ST338（1 株）和ST804（1 株）。分子特征分析結(jié)果表明，CA-MRSA 中以t437-ST59 克隆為主，每個(gè)菌株的具體分子特征信息見表3。

三、CA-MRSA 對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性

采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)CA-MRSA 對(duì)常用抗生素的敏感性，結(jié)果表明，CA-MRSA 對(duì)氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類耐藥率高于β-內(nèi)酰胺類抗生素。9 株CA-MRSA 菌株中有8 株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類耐藥，其中有2 株D-試驗(yàn)陽性，為誘導(dǎo)性大環(huán)內(nèi)酯和林可霉素及鏈陽霉素B 耐藥（inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B,iMLSB）表型，攜帶耐藥基因erm(C)，另外6 株D-試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表現(xiàn)為固有型大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽霉素B 耐藥 （constitutive macrolide-lincosamidestreptogramin B,cMLSB），由erm(B)基因介導(dǎo)。此外，有8 株CA-MRSA 菌株對(duì)氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生耐藥，主要對(duì)卡那霉素耐藥，也有對(duì)妥布霉素耐藥及慶大霉素耐藥的菌株，每株CA-MRSA 具體的耐藥情況見表3。

四、CA-MRSA 菌株pvl 基因攜帶情況

9 株CA-MRSA 菌株中有5 株檢測(cè)出pvl 基因陽性，主要集中在t437-ST59 克?。? 株），另外一株分子特征為t437-ST338，表明從這些住院患者標(biāo)本中分離的CA-MRSA 具有典型的克隆流行特征，且攜帶pvl 基因。

表2 耐藥基因和毒力基因引物

表3 CA-MRSA 菌株的分子特征、耐藥情況及毒力基因

討 論

MRSA 是臨床上引起患者感染的重要病原體，由于其大多具有多重耐藥性，使得治療比較困難。近年來的臨床數(shù)據(jù)表明，毒力較強(qiáng)的CA-MRSA 菌株也正逐漸進(jìn)入醫(yī)院環(huán)境中，引起住院患者的感染[2-3,9]。有研究報(bào)道，我國(guó)的HA-MRSA 流行克隆為ST239-SCCmecⅢ，CA-MRSA 流行克隆為ST59-SCCmecⅣ、ST59-SCCmecⅤ[1,10]。典型的CA-MRSA 菌株一般僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，但也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著菌株的進(jìn)化，CA-MRSA 逐漸開始對(duì)非β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥，尤其是對(duì)大環(huán)內(nèi)酯和林可霉素等耐藥[2,9-11]。因此，對(duì)CA-MRSA 的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，具有重要的臨床意義。本研究收集分離自住院患者標(biāo)本的CA-MRSA 菌株，對(duì)其分子特征和耐藥性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步監(jiān)測(cè)CA-MRSA 流行及治療、控制CA-MRSA 感染提供研究依據(jù)。

一、CA-MRSA 分子特征和耐藥性

本研究共收集到9 例CA-MRSA 菌株，在分子流行病學(xué)特征上有5 株為t437-ST59 型，與報(bào)道的CA-MRSA 流行克隆一致，表明CA-MRSA 菌株不再局限于社區(qū)環(huán)境，也進(jìn)入了醫(yī)院環(huán)境中。2013 年，《公共科學(xué)圖書館病原體》雜志上一項(xiàng)數(shù)理模型研究[12]預(yù)測(cè)，CA-MRSA 菌株與HA-MRSA 菌株將會(huì)在彼此的環(huán)境中共存，認(rèn)為由于HA-MRSA 菌株具有多重耐藥性，使其能在抗生素使用較多的醫(yī)院環(huán)境中流行，而CA-MRSA 菌株的耐藥性較低，則在社區(qū)流行傳播，但隨著抗生素的使用、菌株耐藥性的改變以及人群結(jié)構(gòu)的變化，CA-MRSA 菌株會(huì)與HA-MRSA 菌株在醫(yī)院環(huán)境中同時(shí)存在。因此，采用傳統(tǒng)的流行病學(xué)定義對(duì)CA-MRSA 進(jìn)行區(qū)分具有一定的局限性，采用分子特征對(duì)MRSA 菌株進(jìn)行區(qū)分可以作為有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本研究的前期研究顯示，鼻腔攜帶MRSA 菌株在CA-MRSA 傳播中具有重要作用[13]，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步在大規(guī)模樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。2011 年的美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)指南指出，克林霉素、四環(huán)素及利奈唑胺等是治療CA-MRSA 感染的重要藥物，而耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，歐美地區(qū)CA-MRSA 對(duì)克林霉素和四環(huán)素的耐藥率為3%～24%[14]。另外一項(xiàng)來自國(guó)內(nèi)的研究數(shù)據(jù)表明，我國(guó)的CA-MRSA 菌株對(duì)克林霉素的耐藥率竟高達(dá)92%[15]。這表明CA-MRSA 的耐藥性日益增加，且呈現(xiàn)對(duì)多種非β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥（多重耐藥）的趨勢(shì)。在本研究的9 株CA-MRSA 菌株中，有8 株對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥，進(jìn)一步分析其耐藥表型，檢測(cè)耐藥基因后發(fā)現(xiàn)，CA-MRSA 中以cMLSB耐藥表型為主，主要為erm(B)基因介導(dǎo)，而HA-MRSA 中主要為erm(A)和erm(C)基因介導(dǎo)[13]，提示相對(duì)于erm(A)和erm(C)基因，erm(B)基因較小且位于可以水平傳播的質(zhì)粒上，使得這種耐藥機(jī)制得以在菌株之間廣泛傳播[15]。結(jié)合分子特征與耐藥表型及機(jī)制可以發(fā)現(xiàn)，t437-ST59 克隆主要為erm(B)基因介導(dǎo)的cMLSB耐藥表型，其他克隆如t034-ST804、t008-ST8 具有erm(C)基因介導(dǎo)的iMLSB耐藥表型，因此在探索耐藥機(jī)制的同時(shí)，對(duì)CA-MRSA 菌株的分子特征進(jìn)行研究，也具有重要意義。

二、pvl 基因表達(dá)差異

本研究對(duì)與CA-MRSA 密切相關(guān)的pvl 基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9 株CA-MRSA 中有5 株攜帶pvl 基因，這表明并非所有的CA-MRSA 均攜帶pvl基因。近來有另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，pvl 陰性CA-MRSA引起的感染增加，但從皮膚與軟組織中分離的CAMRSA 菌株pvl 基因的攜帶率仍然較高[16]，這值得進(jìn)一步探究。雖然有些pvl 基因陽性的CA-MRSA菌株感染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的感染性疾病，如壞死性筋膜炎，但pvl 基因在CA-MRSA 感染發(fā)病中的作用一直未能被完全確認(rèn)，臨床上觀察到pvl 基因陽性CA-MRSA 與pvl 基因陰性CA-MRSA 所引起的感染率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]，這可能與其他的影響因素（如宿主免疫）有關(guān)。

總而言之，本研究對(duì)分離自住院患者標(biāo)本的9 株CA-MRSA 菌株進(jìn)行了分子特征及耐藥性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有5 株屬于流行克隆t437-ST59-SCCmecⅣ、t437-ST59-SCCmecⅤ；菌株對(duì)氨基糖苷類藥物（主要為卡那霉素）、紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，表明致病性較強(qiáng)的CA-MRSA 菌株正逐漸進(jìn)入醫(yī)療環(huán)境中，同時(shí)其對(duì)非β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性也逐漸增加，提示臨床應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控住院患者CA-MRSA 感染。