斗竹的開花生物學特性研究

劉海文，趙婉琪，肖 姣，國春策，楊光耀，于 芬*

(1 江西農(nóng)業(yè)大學 林學院，南昌 330045；2 江西省竹子種質資源與利用重點實驗室，南昌 330045)

中國竹林面積約為6.41×106hm2，是重要的森林資源，廣泛應用于日常生活的各個領域，具有較高的經(jīng)濟價值[1-3]。但竹類植物開花不可預測，且大多數(shù)竹種開花周期較長，花后即死亡，嚴重危害竹林的可持續(xù)發(fā)展[4]。全面了解竹類植物的開花規(guī)律特征和生殖生物學特性，對于竹類植物的系統(tǒng)分類、竹林的可持續(xù)經(jīng)營管理以及遺傳改良都非常必要。近年來有關竹類植物開花的研究逐漸增多[5-7]，如毛竹(Phyllostachysedulis)、早竹(Ph.violascens)、角竹(Ph.fimbriligula)、雷竹(Ph.violascenscv. Prevernalis)、月月竹(Menstruocalamussichuanensis)、鵝毛竹(Shibataeachinensis)、新小竹(Neomicrocalamusprainii)等[8-14]，但有關斗竹(Oligostachyumspongiosum)開花的研究未見報道。

斗竹隸屬竹亞科(Bambusoideae)少穗竹屬(Oligostachyum)，廣泛分布于中國廣西地區(qū)林下、林緣地帶。地下莖單軸散生，稈型細直，通常高約5 m，葉片細小[15]，是優(yōu)良的園林觀賞綠化竹種。江西農(nóng)業(yè)大學竹類種質園內的斗竹1994年移栽自井岡山，于2019年4月份出現(xiàn)開花現(xiàn)象。本研究對斗竹的開花規(guī)律、花器官形態(tài)特征、花后更新等開花生物學特性以及大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育進行了觀察，并探究了其結實率低的原因，為竹類植物的系統(tǒng)分類及生殖生物學研究提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西農(nóng)業(yè)大學竹類植物種質園內，地處江西省中部偏北位置，115°49′11″～115°49′23″ E，28°46′00″～28°46′30″ N，海拔49.5 m，屬中亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫17～17.7 ℃，極端最高氣溫40.9 ℃，極端最低氣溫-15.2 ℃，年日照時數(shù)1 772～1 845 h，年平均降水量1 567.7～1 654.7 mm。地勢平坦，土壤類型為黏重紅壤，微酸性。竹林樣地面積約492 m2。

1.2 研究方法

1.2.1 竹林開花動態(tài)野外觀測了斗竹的花期、開花動態(tài)及林相變化，并統(tǒng)計花后結實率。開花時期參照Dafni[16]研究進行劃分，即開花初期(竹林內約25%竹株開花)、開花盛期(竹林內50%以上的竹株開花)、開花后期(竹林內25%以下的竹株仍在開花)和開花末期(竹林內少于10%的竹株仍在開花)。

1.2.2 花器官形態(tài)觀察采集不同發(fā)育階段的斗竹花序，立即放入有冰袋和少量水的保溫箱(4～5 ℃)中。統(tǒng)計各花序內小穗數(shù)量、小穗長度、苞片和小花數(shù)量，并觀察各組成部分的數(shù)量、長寬、色澤等特性，ZEISS Stemi 2000體視顯微鏡下進行拍照。

1.2.3 石蠟制片和顯微觀察采用石蠟制片法。將固定(70% FAA)后的材料取出，采用Ehrlich’s蘇木精染色液將材料整染24～48 h。系列梯度乙醇脫水，二甲苯進行透明，石蠟包埋后于Leica RM 2235旋轉切片機上切取厚度為7～8 μm的切片，置于Zeiss AX10生物顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計軟件進行處理，Photoshop進行圖像處理排版。

2 結果與分析

2.1 斗竹開花林相及結實情況

2019年4月下旬至5月下旬，江西農(nóng)業(yè)大學竹類植物種質園內的斗竹林出現(xiàn)全體開花現(xiàn)象。斗竹為一次性全體開花的散生竹，花期短，約持續(xù)45 d。相較于營養(yǎng)生長時期，即將開花的斗竹林在外觀上具有明顯變化，表現(xiàn)為竹葉失綠，部分脫落，竹稈微黃，整個竹林呈現(xiàn)衰敗趨勢(圖版Ⅰ，1～2)。2019年4月中旬，花序抽出，成花量極大(圖版Ⅰ，3～4)。5月初少量的花開始開放，開花時由漿片撐開外稃，花藥從內部伸出，此階段開放的小花集中于花序頂部小穗的基部(圖版Ⅰ，5)；5月上旬為斗竹的盛花期，竹林內一半以上的竹花完全開放，開放的小花多集中于花序頂部小穗的中、下部(圖版Ⅰ，6～7)；5月下旬，花期結束，花后竹稈變黃，竹葉脫落，小穗枯黃，竹林內未發(fā)現(xiàn)實生苗，竹林結構明顯呈衰老趨勢(圖版Ⅰ，8～11)。至2020年3月，斗竹林完全枯死。根據(jù)統(tǒng)計2 780枚斗竹小花的結實情況，收獲221枚種子，種子多發(fā)育自小穗中、下部的小花，每枚小穗基本都有1枚種子形成，結實率為8.1%，但小穗上的幼果被蟲蝕空，蟲害嚴重(圖版Ⅰ，12)。

2.2 花、果形態(tài)結構

斗竹花序為圓錐狀花序，花序柄長4～15 cm，每花序含4枚小穗，具小穗柄，小穗柄較短，長約2 cm，被柔毛(圖版Ⅱ，1)；小穗細長，長約4～10 cm，基部具3枚苞片，第1枚苞片長約3 mm，第2枚苞片長約5 mm，第3枚苞片與外稃大小相似，長約1 cm，苞片內無小花。每枚小穗含小花5～17朵，頂部小花不發(fā)育(圖版Ⅱ，2)；小花由外稃、內稃、漿片、雄蕊、雌蕊組成(圖版Ⅱ，3)；內、外稃片各1枚，外稃青綠色，長約12 mm，披針形，頂端尖銳，邊緣紫紅色，脊間2脈，被白毛(圖版Ⅱ，4)；內稃披針形，對生于外稃內側，長約10 mm，頂端2裂(圖版Ⅱ，5)；漿片3枚，長2～3 mm，寬約2 mm，1枚漿片包被于內稃中，另外2枚漿片貼近外稃，卵圓形，頂端被纖毛，具多條縱脈(圖版Ⅱ，6)；雄蕊為4～6枚(多為6)，花藥長7～10 mm，幼時黃綠色，成熟后為黃色，密被紫色斑點(圖版Ⅱ，7～9)；雌蕊1枚，子房長橢圓形，表面平滑無毛，柱頭3裂，羽毛狀，長2～3 mm(圖版Ⅱ，10)；花粉粒球形，表面紋飾顆粒狀，具單個萌發(fā)孔，萌發(fā)孔具有明顯的內凹孔環(huán)(圖版Ⅱ，11)；穎果，橢圓形，去稃果實深褐色，長6～10 mm，直徑約1～3 mm，腹部縱溝槽明顯，花柱宿存(圖版Ⅱ，12)。

2.3 小花開放動態(tài)

斗竹小花為開放型。未開放時外稃緊閉，開花時漿片吸水膨脹撐開外稃，花藥從內部伸出(圖版Ⅲ，1～3)；隨后，花絲迅速下垂，柱頭從稃片內露出，花藥開始散粉，屬于雌雄同熟型(圖版Ⅲ，4)；花粉主要依靠風力及蟲媒傳播；完成散粉后，花絲、花藥回縮，稃片閉合(圖版Ⅲ，5～6)。花藥的露出與散粉受到氣溫、濕度等環(huán)境因素的影響較大，晴天光照強，花藥散粉的速度更快。就整個花序來看，位于花序頂端的小穗先開放，開花順序為自上而下；而就單個小穗來看，開花順序自小穗基部依次向上；通過分別對同一小穗上不同部位的小花進行解剖，發(fā)現(xiàn)雄蕊(圖版Ⅳ，A1～E1)和雌蕊(圖版Ⅳ，A2～E2)的發(fā)育順序均為自下而上，即基部的小花先成熟，并依次向上發(fā)育，位于頂部的小花發(fā)育不全，不開放。

2.4 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

斗竹的每枚花藥具有4個小孢子囊(圖版Ⅴ，1)。對長度為0～1 mm花藥進行橫切，發(fā)育初始階段花藥橫切面為橢圓形(圖版Ⅴ，2)，隨后在4個角隅處分化出孢原細胞，橫切面上，花藥角隅處開始突出(圖版Ⅴ，3～4)。花藥長度在1～2 mm時，孢原細胞進行分化，進入造孢細胞時期，初生造孢細胞經(jīng)過分化、發(fā)育依次形成次生造孢細胞(圖版Ⅴ，5～6)，進而發(fā)育為小孢子母細胞，此階段花粉壁分化完成，由內向外依次為：絨氈層、中層、藥室內壁和表皮(圖版Ⅴ，7～8)?；ǚ勰讣毎?jīng)過前期 Ⅰ-末期 Ⅰ的連續(xù)過程(圖版Ⅴ，9～11)，首次減數(shù)分裂的結果形成了二分體，第一次減數(shù)分裂期間，中層細胞開始變得扁平(圖版Ⅴ，12)。緊接著第二次減數(shù)分裂，同樣經(jīng)歷前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ(圖版Ⅴ，13)和末期Ⅱ(圖版Ⅴ，14)，沉積胼胝質壁，形成左右對稱型的四分體，此階段，中層完全解體(圖版Ⅴ，15)。

雄配子發(fā)育過程始于胼胝質壁中釋放出的小孢子，然后細胞核增大，細胞壁加厚，中央大液泡形成，細胞核邊緣化，此時小孢子為單核靠邊期。此階段花粉囊壁僅包括表皮細胞和藥室內壁細胞各一層，橫切面上表皮細胞呈方形，體積顯著增大并具有明顯的角質層，藥室內壁細胞的細胞壁發(fā)生帶狀加厚，而中層、絨氈層已完全降解(圖版Ⅴ，16)。小孢子在進行了1次不對等的有絲分裂后，形成2個大小不等的核，較大、居中的為營養(yǎng)核，貼近花粉壁的為生殖核，斗竹成熟花粉粒為2-細胞型(圖版Ⅴ，17)。花粉發(fā)育過程中也出現(xiàn)異常收縮及空腔的敗育花粉粒(圖版Ⅴ，18～20)。

2.5 大孢子及雌配子體發(fā)育

斗竹子房珠被2層，為厚珠心。發(fā)育初期，在珠心表皮下形成一個細胞，其形態(tài)顯著區(qū)別于其他細胞，細胞體積大，細胞核較大、居中，細胞質濃厚，即孢原細胞；大孢子母細胞由孢原細胞直接發(fā)育，其細胞核增大(圖版Ⅵ，1)。隨后，大孢子母細胞開始進入減數(shù)分裂階段。經(jīng)過第一次減數(shù)分裂，大孢子母細胞分裂形成二分體(圖版Ⅵ，2)；第二次減數(shù)分裂時二分體的兩個細胞各自分裂在沿著珠孔下方的珠心形成四分體。

成熟胚囊為蓼型。功能大孢子的細胞核在第一次有絲分裂后，形成的2個細胞分別向細胞兩端移動，形成2核胚囊(圖版Ⅵ，3)；第二、三次有絲分裂后，分別形成4核胚囊(圖版Ⅵ，4～5)和8核胚囊；珠孔端、合點端各有1個細胞核向胚囊中央游移，組成極核(圖版Ⅵ，6)；靠近合點端的3個細胞反復分裂組成反足細胞群(圖版Ⅵ，7)；位于珠孔端的3個細胞核呈“品”形，包括1個卵細胞和2個助細胞共同組成卵器(圖版Ⅵ，8～9)；反足細胞、中央細胞核和卵器共同組成成熟胚囊，雌配子體形成。

3 討 論

竹類植物作為無性系克隆的多年生植物，往往需要經(jīng)歷漫長的生長過程才會開花結實，其開花特點具有共同性即開花周期長、缺乏規(guī)律性、花后死亡等[17-18]。然而，開花竹種之間也存在一定的差異，主要表現(xiàn)在開花習性、花后結實率以及竹林更新繁殖方式上。竹子開花習性復雜多樣，Zheng等[19]基于對630多種竹類植物開花結實信息的分析，根據(jù)收集到的大量例子，認為竹子開花習性可分為4種類型：零星開花、群體同步開花、群體同步開花和零星開花相結合以及部分開花[20]。群體開花后死亡會對竹種種質資源造成嚴重的威脅，珍稀竹種針麻竹(Cephalostachyumscandens)和貢山竹(Gaoligongshaniamegathyrsa)由于自然開花處于瀕危狀態(tài)[21]；浙江上虞林業(yè)科技重點推廣竹種——角竹大面積開花枯死，導致林農(nóng)損失慘重，竹種資源保存出現(xiàn)危機[22]。根據(jù)連續(xù)兩年對斗竹的開花林相進行觀察發(fā)現(xiàn)，斗竹屬于一次性、大量同步開花類型，花期非常短，且花后次年竹林整體衰敗死亡造成對其生殖生物學的研究受限。

在自然界中，花后竹類植物通過有性繁殖和無性繁殖的方式進行更新。研究表明大部分野生竹種依靠有性繁殖進行更新，結實率高達79%，而栽培種則多以無性更新方式繁衍后代，結實率較低為27%，大部分通常不結實，或出現(xiàn)種子敗育現(xiàn)象[23]；程有龍等[22]研究栽培角竹發(fā)現(xiàn)，因長期來依靠無性繁殖方式繁衍后代，其有性繁殖機能明顯退化，而分布在懸崖峭壁上的開花爬竹(Ampelocalamusscandens)開花后結實量大，種子飽滿，完全可以進行天然更新[24]。江西農(nóng)業(yè)大學竹類植物種質園內的斗竹為移栽竹種，通過統(tǒng)計花后2 780枚小花的結實情況發(fā)現(xiàn)，斗竹的結實率為8.1%，結實率較低。

影響竹類植物結實率的因素很多，如雌雄蕊敗育、開花時空特性限制、傳粉有效率低、生境條件不適等[25-27]。張文燕等[28]對五月季竹(Ph.reticulata)開花結實研究發(fā)現(xiàn)，花藥和花粉敗育影響其結實量，結合自然授粉不良、雌蕊畸形等綜合因素導致其基本無結實。根據(jù)對水竹(Ph.heteroclada)開花生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，雌蕊發(fā)育異常導致柱頭可授率低是其有性生殖過程中的薄弱環(huán)節(jié)，同時多雨潮濕的氣候條件導致花器官發(fā)育完全被昆蟲幼蟲破壞[29]。袁金玲等[30]發(fā)現(xiàn)綠竹屬的3個竹種均因雌蕊退化而難以結實；孝順竹(Bambusamultiplex)的子房、胚珠均發(fā)生早期敗育，且雌蕊結構異常，造成其結實率低[31]；林樹燕[32]對鵝毛竹(Shibataeachinensis)研究發(fā)現(xiàn)因柱頭的不外露和不可授性，加上花粉本身的敗育，使其自然授粉率基本為零。

斗竹的胚囊發(fā)育正常，但花粉存在不同程度的敗育，存在畸形花粉和空腔花粉現(xiàn)象，僅有少數(shù)正?；ǚ哿?，花粉敗育可能是影響斗竹結實率的原因之一。此外，竹林蟲害影響嚴重、花期雨水過多等多方因素可能造成了斗竹結實率降低。而且花后斗竹林無鞭生新竹株，也未見實生苗，因此斗竹的花后更新方式為有性繁殖，但栽培斗竹的花粉敗育以及外部環(huán)境影響共同導致其結實率較低。

4 結 論

斗竹為一次性全體開花的散生竹，花期為4月下旬～5月下旬，盛花期為5月上旬，成花量大。圓錐狀混合花序，每枚花序含4枚小穗，每枚小穗具小花5～17朵，小花為開放型穎花，由1枚內稃、1枚外稃、3枚漿片、1枚雌蕊(柱頭3裂，羽毛狀)、4～6枚雄蕊(多為6枚)組成，雌雄同熟。同一花序內小穗均向基發(fā)育，而同一小穗內不同部位的小花均向頂發(fā)育。果實為穎果。自然條件下結實率8.1%，竹林更新以有性繁殖為主。

花藥具4個藥室，花藥壁發(fā)育為基本型，由表皮、內壁、中層和絨氈層4層細胞組成。小孢子四分體為左右對稱型，減數(shù)分裂時胞質分裂為連續(xù)型，成熟花粉粒為2-細胞型；花粉存在敗育現(xiàn)象，出現(xiàn)畸形或空腔花粉粒。雌蕊結構均完整，子房皆為單心皮1室，胚珠倒生，厚珠心；胚囊為蓼型，發(fā)育正常，成熟胚囊由卵器、極核和反足細胞群構成。本研究探討了斗竹的開花特性、花器官形態(tài)特征及其大小孢子和雌雄配子體的發(fā)育，為該屬系統(tǒng)分類及生殖生物學提供基礎資料。