白茅苷緩解STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病幼齡鼠肝損傷

丁艷琴，湯興萍，徐 奎，李 萍，李 玲

（1.河西學(xué)院附屬?gòu)堃慈嗣襻t(yī)院兒科，甘肅張掖 734000；2.張掖市中醫(yī)院糖尿病專科，甘肅張掖，734000；3.河西學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院教科辦，甘肅張掖 734000）

I 型糖尿病又稱為胰島素依賴性糖尿病，是指體內(nèi)胰島素缺乏導(dǎo)致葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂，血糖水平持續(xù)升高，并最終形成糖尿病［1］。該病多發(fā)于兒童和青少年，起病迅速，長(zhǎng)時(shí)間的胰島素不足容易造成酮癥酸中毒，嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)I 型糖尿病全年齡段發(fā)病率為1.01/10 萬(wàn)人，由于人們的不重視及生活習(xí)慣差等因素，近幾年發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)［2］。目前，臨床上針對(duì)I 型糖尿病的治療方案主要有胰島移植、基因治療及外源性補(bǔ)充胰島素，但需要患者長(zhǎng)期堅(jiān)持以及良好的生活習(xí)慣［3］。白茅苷是白芷根的活性成分之一，具有除濕止痛、消腫排膿、抗炎癥、抗腫瘤等功效［4］。有研究報(bào)道，白茅苷已被用于高血壓、心血管及急性肝損傷等疾病中［5-7］。但白茅苷在I型糖尿病中的研究鮮見報(bào)道，因此，本研究通過建立鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的I型糖尿病幼鼠模型，探討白茅苷對(duì)I型糖尿病幼鼠肝損傷、過氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)的影響，為白茅苷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

白茅苷（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（貨號(hào)B20929），鏈脲佐菌素購(gòu)自（純度≥98%）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)S8050），HE 染色試劑盒、TUNEL 試劑盒和ELISA 試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，兔單克隆抗體及HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，酶標(biāo)儀（Rayto，RT6100），臺(tái)式高速離心機(jī)（大龍，D3024R，最大離心力21 380×g），成像系統(tǒng)（上海天能科技公司，Tanon-1600R），光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）。全自動(dòng)生化分析儀（日本HITACH，7600）。

1.2 動(dòng)物分組、建模及給藥

無特殊病原菌（SPF）級(jí)BALB/c雄性幼齡鼠（1～2 周齡，體質(zhì)量15～20 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2016-0008，使用許可證號(hào)SYXK（京）2017-0022，健康狀況良好，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用過程中嚴(yán)格遵守3R 原則，并通過河西學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：每只幼鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理，24 ℃條件下封閉群養(yǎng)。建模：參照文獻(xiàn)［8］建立I型糖尿病幼鼠模型，健康對(duì)照組幼鼠進(jìn)行正常喂食飲水，模型組和模型加藥組禁食不禁水，12 h 后模型組進(jìn)行腹腔注射60 mg/kg 的鏈脲佐菌素誘導(dǎo)I 型糖尿病幼鼠模型，幼鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿等癥狀時(shí)表明造模成功，造模成功后，模型加藥組幼鼠參照文獻(xiàn)［9］分別灌胃給藥3、6 和12 mg/kg 的白茅苷，72 h 后測(cè)定空腹血糖、血清胰島素、肥胖指數(shù)，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血脂四項(xiàng)，處死小鼠，收集肝臟組織和主動(dòng)脈血進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 HE染色觀察肝損傷

取幼鼠肝組織，用40 g/L 多聚甲醛固定幼鼠肝組織，石蠟包埋切片，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，二甲苯脫蠟，行HE 染色，脫水透明并封片后，在光鏡下觀察拍照并記錄組織學(xué)形態(tài)變化。

1.4 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

取各組幼鼠肝組織，用40 g/L 多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)組織修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和室溫平衡后，加入反應(yīng)液按TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行染色。細(xì)胞核被染成藍(lán)色或藍(lán)紫色，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色或褐色。

1.5 Western blot 檢測(cè)線粒體損傷標(biāo)記蛋白表達(dá)水平

取各組幼鼠肝組織，預(yù)冷的PBS 洗滌2～3 次，然后用手術(shù)剪成小塊并置于勻漿研磨儀中研磨，研磨均勻后用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，12 000 r/min（離心機(jī)半徑為84.993 mm）離心15 min取上清，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定組織蛋白濃度，每孔上樣15～20 μg，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1：500），4℃搖床孵育過夜，回收一抗并加入HRP 標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1：4 000），室溫孵育2 h。采用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，經(jīng)PS 整理去色，Alpha 軟件分析光密度值，計(jì)算各組幼鼠中Bax、Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 蛋白相對(duì)表達(dá)量（內(nèi)參ACTIN），結(jié)果以目標(biāo)條帶與內(nèi)參比值表示，獨(dú)立進(jìn)行試驗(yàn)3次，最終結(jié)果取平均值。

1.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子水平

收集各組幼鼠主動(dòng)脈血，3 000 r/min（r=84.993 mm）4 ℃條件下離心10 min，取血清樣本，按ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)各組幼鼠血清中SOD、MDA、IL-6、TNF-α和IL-1β的含量水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0和GraphPad Prism6.0軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，兩兩比較采用Sidak 法，以P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白茅苷對(duì)I 型糖尿病幼齡鼠血清胰島素和血糖水平的影響

采用糖耐量實(shí)驗(yàn)（OGTT）檢測(cè)各組小鼠血糖和空腹血清胰島素水平，并測(cè)量各組小鼠肥胖指數(shù)，經(jīng)單因素方差分析，五組間肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素水平（μU/L）和空腹血糖水平（mmol/L）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.262、94.570、119.696，P=0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.997、1.000、0.999），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000；圖1）。

圖1 小鼠肥胖指數(shù)、空腹血清胰島素和血糖指標(biāo)Fig.1 Obesity index，fasting serum insulin and fasting glucose in mice

2.2 白茅苷對(duì)I型糖尿病幼齡鼠血脂水平的影響

自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清中總膽固醇（TC，mmol/L）、甘油三酯（TG，mmol/L）、高密度脂蛋白（HDL，mmol/L）、低密度脂蛋白（LDL，mmol/L）水平，經(jīng)單因素方差分析，五組間TC、TG、LDL、HDL 水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=95.474、27.156、42.704、153.816，P=0.000、0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000、1.000、1.000、0.989），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.007、0.000、0.000），與12 mg/kg白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000，圖2）。

圖2 血脂四項(xiàng)檢測(cè)Fig.2 Four items of blood lipid tests

2.3 白茅苷對(duì)I型糖尿病幼齡鼠肝損傷的影響

HE 染色觀測(cè)I 型糖尿病小鼠肝損傷程度。健康對(duì)照組小鼠肝組織形態(tài)正常，排列規(guī)則，無炎性浸潤(rùn)等病變情況。模型組小鼠肝組織紊亂，無完整肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松、彌漫性水腫，匯管區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生。低劑量組（3 mg/kg白茅苷組）小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見少量正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，仍然可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中高劑量組（6 和12 mg/kg 白茅苷組）小鼠肝組織結(jié)構(gòu)趨于正常，肝小葉結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，匯管區(qū)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈輻射狀排列（圖3）。

2.4 白茅苷對(duì)I型糖尿病幼齡鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 染色觀測(cè)各組小鼠肝細(xì)胞凋亡情況。健康對(duì)照組小鼠肝組織中未見凋亡細(xì)胞，肝組織結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠肝組織中可見大量凋亡細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)紊亂。低劑量組（3 mg/kg 白茅苷組）小鼠肝組織中仍可見大量凋亡細(xì)胞，組結(jié)構(gòu)紊亂。中高劑量組（6和12 mg/kg白茅苷組）小鼠肝細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，組織結(jié)構(gòu)趨于正常（圖4）。

圖3 肝組織病理染色圖Fig.3 Pathological staining image of liver tissue

圖4 肝組織凋亡染色圖Fig.4 Staining image of liver tissue apoptosis

2.5 白茅苷對(duì)I 型糖尿病幼齡鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

SOD 和MDA 試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中SOD（U/mL）和MDA（mmol/mL）含量水平，經(jīng)單因素方差分析，五組間SOD 和MDA 含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.216、24.309，P=0.000、0.000），采用Sidak法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)模型組與3 mg/kg白茅苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000、1.000），而與6 mg/kg白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.068、0.022），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001、0.001；圖5）。

圖5 SOD、MDA含量水平Fig.5 SOD and MDA content levels

2.6 白茅苷對(duì)I型糖尿病幼齡鼠線粒體損傷的影響

Western blot 檢測(cè)各組小鼠線粒體中Bax/Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 蛋白表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，五組間Bax/Bcl-2、caspase-3、c-Myc 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=255.894、42.415、159.547，P=0.000、0.000、0.000），采用Sidak 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)模型組與3 mg/kg 白茅苷組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.991、0.998、1.000），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000；圖6）。

2.7 白茅苷對(duì)I 型糖尿病幼齡鼠血清中炎癥因子水平的影響

ELISA 檢測(cè)各組小鼠血清中IL-6（pg/mL）、TNF-α（pg/mL）和IL-1β（pg/mL）含量水平，經(jīng)單因素方差分析，五組間IL-6（F=15.893，P=0.000）、TNF-α（F=48.912，P=0.000）、IL-1β（F=25.166，P=0.000）含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Sidak 法進(jìn)一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)模型組與3 mg/kg 白茅苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000、1.000、1.000），而與6 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017、0.007、0.003），與12 mg/kg 白茅苷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007、0.000、0.001；圖7）。

圖6 Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3和c-Myc蛋白表達(dá)水平Fig.6 Bax/Bcl-2，cleaved cas3/cas3 and c-Myc protein expression levels

3 討論

圖7 IL-6、TNF-α和IL-1β含量水平Fig.7 Content levels of IL-6，TNF-α and IL-1β

I型糖尿病是自身異常免疫應(yīng)答破壞胰島B 細(xì)胞，從而引起的一種自身免疫代謝性疾病，胰島B細(xì)胞的損傷與多種免疫細(xì)胞和炎癥因子有關(guān)，如T淋巴細(xì)胞、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等［10-12］。STZ 是一種天然的化學(xué)物質(zhì)，能特異性的破壞分泌胰島素的胰島B 細(xì)胞，由于其誘導(dǎo)的I 型糖尿病動(dòng)物模型臨床表現(xiàn)與人的組織病理表現(xiàn)極為相似，且導(dǎo)致I 型糖尿病產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)及氧化應(yīng)激等，因此，STZ 誘導(dǎo)的I型糖尿病動(dòng)物模型常被用于實(shí)驗(yàn)研究［13］。本研究利用STZ誘導(dǎo)I型糖尿病動(dòng)物模型，觀測(cè)白茅苷對(duì)I 型糖尿病模型幼鼠肝損傷、過氧化應(yīng)激及免疫應(yīng)答的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白茅苷能夠緩解STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病模型幼鼠肝損傷，降低過氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答等。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白茅苷給藥治療后，I型糖尿病幼鼠肥胖指數(shù)、空腹血糖、空腹血清胰島素和血脂四項(xiàng)水平均明顯降低，結(jié)果提示，白茅苷在I型糖尿病幼鼠胰島功能中具有調(diào)節(jié)作用，為明確白茅苷調(diào)節(jié)I 型糖尿病胰島功能的作用機(jī)制，我們還檢測(cè)了幼鼠肝損傷、細(xì)胞凋亡、過氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子的水平。

I 型糖尿病發(fā)生時(shí)，由于胰島素分泌不足或相對(duì)缺乏會(huì)使肝臟脂代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生酮癥酸中毒，引起肝臟腫大，脂肪組織浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致肝組織功能損傷［14］。因此，增加I 型糖尿病患者體內(nèi)胰島素分泌的同時(shí)，還應(yīng)防止肝功能受損。本研究結(jié)果顯示，白茅苷顯著改善I 型糖尿病幼鼠肝組織病理?yè)p傷，抑制肝細(xì)胞凋亡，結(jié)果進(jìn)一步提示白茅苷在I型糖尿病幼鼠胰島功能和肝功能中的具有調(diào)控作用。

氧化應(yīng)激也是胰島B 細(xì)胞受損的重要因素之一，超氧化物歧化酶（SOD）是氧自由基清除酶，能夠清除細(xì)胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物保護(hù)細(xì)胞免受氧化和過氧化產(chǎn)物的損害［15］。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)大量產(chǎn)生或積累MDA 會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而影響細(xì)胞正常功能［16］。研究發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導(dǎo)的I 型糖尿病小鼠SOD水平均有明顯降低，MDA明顯增高，且MDA和SOD含量能間接的反應(yīng)細(xì)胞損傷程度和氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白茅苷給藥治療后，STZ 誘導(dǎo)的I 型糖尿病幼鼠SOD 含量明顯增高，MDA 含量明顯降低。結(jié)果提示，白茅苷通過調(diào)節(jié)I型糖尿病幼鼠氧化應(yīng)激水平緩解幼鼠胰島功能和肝功能損傷。

線粒體是機(jī)體有氧代謝和能量轉(zhuǎn)換的主要場(chǎng)所，與I型和Ⅱ型糖尿病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。I型糖尿病發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)胰島素分泌異常導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）孔開放，使線粒體中促凋亡蛋白的大量釋放并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［18］。Bax/Bcl-2、caspase-3 和c-Myc 是線粒體損傷標(biāo)志物，同時(shí)也是凋亡標(biāo)記蛋白。Bax/Bcl-2和caspase-3高表達(dá)預(yù)示線粒體功能損傷嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞增多［19］。而c-Myc 則與之相反，在I 型糖尿病幼鼠中，c-Myc 能夠激活分泌胰島素的胰島素基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)［20］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)白茅苷給藥治療后，I 型糖尿病幼鼠線粒體中Bax/Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達(dá)明顯降低，c-Myc 表達(dá)增高，結(jié)果提示，白茅苷對(duì)I 型糖尿病幼鼠線粒體功能也具有調(diào)節(jié)作用。

前文提到I型糖尿病是由于機(jī)體自身異常免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島B 細(xì)胞受損的代謝性疾病，因此，檢測(cè)I型糖尿病幼鼠免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子水平能夠間接明確幼鼠胰島功能，而白細(xì)胞介素6（IL-6）、TNF-α和白介素-1β（IL-1β）是重要的炎癥和免疫調(diào)控因子。研究表明，在I型糖尿病發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞通過釋放IFN-γ 激活并釋放IL-6、IL-1β 和TNF-α等，導(dǎo)致胰島B 細(xì)胞損傷甚至死亡［21-22］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白茅苷給藥治療后，I 型糖尿病幼鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量均有明顯降低，結(jié)果提示，白茅苷通過調(diào)節(jié)I型糖尿病幼鼠免疫炎癥因子水平緩解幼鼠因過度免疫反應(yīng)引起的胰島功能損傷。

綜上所述，白茅苷在STZ 誘導(dǎo)的I 型糖尿病幼鼠肝功能、胰島功能和線粒體功能中具有調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制與降低幼鼠肝細(xì)胞凋亡、過氧化應(yīng)激反應(yīng)和免疫反應(yīng)有關(guān)。