低強度聚焦超聲觸發(fā)PLGA阿霉素在細胞內(nèi)空化增加乳腺癌細胞死亡

黃盤輝，羅 瓊，嚴 飛，李紹林

（1.中山大學附屬第五醫(yī)院放射科，廣東珠海 519000；2.華南理工大學醫(yī)學院附屬廣州市第一人民醫(yī)院超聲科，廣東廣州 510180；3.中國科學院深圳先進技術(shù)研究所勞特伯生物醫(yī)學成像研究中心，廣東深圳 518055）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一［1］。常規(guī)化療作為一種常用的非手術(shù)方法，副作用明顯，患者生活質(zhì)量和治療依從性較低［2-3］。阿霉素是癌癥的常用化療藥物之一［4］。然而，阿霉素誘導產(chǎn)生的自由基，在細胞膜水平產(chǎn)生的有害影響，同時將藥物插入DNA中［5］，這些都可能導致非靶器官毒性。因此，將阿霉素嵌入安全性的藥物遞送系統(tǒng)是一個很好的策略［6-7］。PLGA 可通過雙重乳化溶劑［8］、水-水乳狀液［9-10］和乙醇中固體油［11］蒸發(fā)等方法制備。同時PLGA是美國食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準的材料［12-13］。它可用于不同藥物的持續(xù)靶向輸送［14］，包括質(zhì)粒DNA、蛋白質(zhì)、肽和分子量化合物［15-16］。PLGA 微泡還可以作為聲敏劑，同時實現(xiàn)超聲控制藥物釋放［17］。超聲介導的微泡空化治療腫瘤［18-19］，是通過加速固體顆粒間的碰撞［20-22］，直接或間接損傷微球或細胞［23-24］，使更多微泡進入腫瘤細胞中。需要注意的是，這些化療藥物在血管內(nèi)釋放也會損傷血管，從而導致治療藥物較少積聚在靶血管中［25］，積聚在非靶器官上造成毒性作用。細胞內(nèi)藥物釋放是指藥物載體進入細胞內(nèi)，通過特異性刺激以增強細胞內(nèi)藥物釋放［26］，提高病變部位的生物利用度以減少副作用。目前主要是通過刺激反應載體來傳遞藥物，例如pH、氧化還原電位、活性氧、酶和溫度［27-28］。低強度聚焦超聲是指0.3～3 W/cm2聲強的超聲。低強度聚焦超聲聯(lián)合PLGA 微泡細胞的空化通過聲場與微泡相互作用下，微泡因急劇壓縮、閉合破裂而形成微流、沖擊波及射流等激烈過程，使細胞膜上出現(xiàn)可逆性或不可逆性小孔，提高了細胞膜的通透性［29］。細胞內(nèi)空化是直接使超聲介導的空化效應在細胞內(nèi)產(chǎn)生，增加細胞核膜通透性，使藥物進入細胞核內(nèi)［30］。值得注意的是，超聲聯(lián)合PLGA 微泡在細胞內(nèi)發(fā)生空化效應及其應用仍未有報道。因此本研究制備PLGA 包裹的阿霉素聲敏型納米顆粒，聯(lián)合低強度聚焦超聲驗證細胞內(nèi)空化與細胞核的核膜變化關(guān)系，并對比胞內(nèi)釋藥與胞外釋藥對4T1 細胞的增殖能力及侵襲能力的影響，為后續(xù)腫瘤治療提供有效治療思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic acid-glycolic acid copolymer，PLGA；中國大港生物材料有限公司），二硬脂酰基卵磷脂（1，2-distearoyl-snglycero-3-phosphocholine，DSPC；美國阿凡提極性脂質(zhì)公司），二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE；美國阿凡提極性脂質(zhì)公司），阿霉素（中國百靈威科技有限公司），細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI；中國碧云天生物技術(shù)有限公司），細胞增殖（毒性）檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8；中國碧云天生物技術(shù)有限公司），超聲破碎儀（美國超聲波材料公司），均質(zhì)機（德國IKA 集團），透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司），納米電徑電勢分析儀（英國Malvern 公司），全自動超聲系統(tǒng)（中國圣祥高科技有限公司），多功能酶標儀（美國Biotek 公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），鼠源性4T1 細胞及穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的4T1 細胞由中國科學院深圳先進技術(shù)研究院嚴飛研究員惠贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 PLGA-DOX 的合成 PLGA-DOX 納米氣泡是使用雙乳化溶劑蒸發(fā)法合成的。將50 mg PLGA和2.5 mg DSPC 溶解在1 mL 二氯甲烷中。將1 mg阿霉素添加到二氯甲烷中進行超聲乳化2 min。乳化后，將5 mL 4%PVA 加入溶液中，并用均質(zhì)機將混合物均質(zhì)（5檔，5 min）。將10 mL 超純水添加到溶液中并再均質(zhì)5 min。將其在室溫攪拌4 h。然后將溶液轉(zhuǎn)移到50 mL EP 試管中進行3 次高速離心（2 500 ×g，5 min）。最后用1 mL 超純水重懸沉淀物，并冷凍干燥24 h。

1.2.2 PLGA-DOX 的特征 使用馬爾文粒徑分析儀對PLGA-DOX 納米氣泡進行粒徑及電位分析，用掃描電鏡分析PLGA-DOX 的表面情況。用酶標儀測量并算其載藥量。

1.2.3 PLGA-DOX 的最佳超聲參數(shù)及IC50將4T1

細胞鋪在96 孔板中，并分別在1 MHz，1 W/cm2，1 min，占空比20%、1 MHz，2 W/cm2，1 min，占空比20%、1 MHz，3 W/cm2，1 min，占 空 比20% 以 及1 MHz，4 W/cm2，1 min，占空比20%這個4個不同聲強下處理4T1 細胞，24 h 后用CCK 8 檢測細胞的增殖情況。另外將4T1細胞鋪在96孔板中，將濃度為0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/mL PLGA-DOX 的培養(yǎng)基加入，24 h后，用CCK 8檢測細胞的生長抑制情況。

1.2.4 細胞攝取率 將乳腺癌細胞（4T1 細胞）鋪在12 孔板中培養(yǎng)，并將適量PLGA-FITC 樣品溶解在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，并添加到孔板。溫育1、3、6、12 和24 h 后，將細胞用PBS 洗滌3 次，在熒光顯微鏡下觀察拍照。然后用胰蛋白酶（含0.25%EDTA）將細胞消化，并用400 μL PBS 重懸進行流式細胞分析。同時將乳腺癌細胞（4T1 細胞）鋪在96 孔板中培養(yǎng)并設(shè)立對照組，并將適量PLGADOX 樣品溶解在RPMI 1640培養(yǎng)基中，并添加到孔板。溫育1、3、6、12 和24 h 后，將細胞用PBS 洗滌3次，用CCK 8檢測各組的細胞活性。

1.2.5 低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)空化誘導細胞內(nèi)藥物釋放 將4T1細胞培養(yǎng)在24孔板中，并分為兩組：對照組和細胞內(nèi)藥物釋放組。將1 mg PLGA-DOX-FITC 樣品溶解在RPMI 1640 培養(yǎng)基中，然后添加到孔板中。孵育6 h后，兩組用PBS洗滌3 次，并用新鮮的RPMI 1640 培養(yǎng)基孵育。對照組不予處理。細胞內(nèi)藥物釋放組用低強度聚焦超聲處理（參數(shù)：1 MHz，2 W/cm2，1 min，占空比20%）。兩組均用Hoechst 染色。然后在熒光顯微鏡上觀察并拍照，并測量細胞核的紅色熒光平均強度，并用電子顯微鏡觀察核膜的情況。

1.2.6 超聲控制PLGA-DOX 的藥物釋放 將新制備的PLGA-DOX 納米氣泡稀釋至含10 g/L 血清的PBS 中，將其分為等體積的對照組和超聲處理組。超聲處理組用低強度聚焦超聲處理，對照組不處理。離心后，取1 mL 上清液用酶標儀測量阿霉素的含量，并向每組補充1 mL 含10 g/L血清的PBS并混合。然后，將它們置于37°C的恒溫振蕩器中，并在0.5、1、3、5、7、24 和48 h 后使用相同的方法采集兩組上清液，以測定阿霉素的含量。

1.2.7 檢測細胞內(nèi)和細胞外藥物釋放中的細胞死亡情況 將4T1 細胞分為5 組，并在12 孔板中培養(yǎng)。①對照組：不作處理。②單獨超聲組：用低強度聚焦超聲處理細胞。③傳統(tǒng)給藥組：將4T1 細胞與PLGA-DOX 孵育6 h。④細胞外藥物釋放組：低強度聚焦超聲處理PLGA-DOX 納米氣泡后，將4T1細胞與經(jīng)預處理的PLGA-DOX 一起培養(yǎng)6 h，用PBS洗3遍，加入培養(yǎng)基。⑤細胞內(nèi)藥物釋放組：在用PLGA-DOX 與細胞孵育6 h 后，用PBS 將4T1 細胞洗滌3 次，加入培養(yǎng)基，低強度聚焦超聲處理。24 h 后，用Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒在流式中檢測5組4T1細胞的死亡情況。

1.2.8 CCK 8 檢測細胞的增殖 將4T1 細胞分為5組，并在96 孔板中培養(yǎng)。①對照組不作處理。②單獨超聲組：用低強度聚焦超聲處理。③傳統(tǒng)給藥組：將4T1 細胞與PLGA-DOX 孵育6 h。④細胞外藥物釋放組：低強度聚焦超聲處理PLGA-DOX 納米氣泡后，將4T1細胞與經(jīng)預處理的PLGA-DOX 一起培養(yǎng)6 h，用PBS 洗3 遍，加入培養(yǎng)基。⑤細胞內(nèi)藥物釋放組：在用PLGA-DOX 與細胞孵育6 h 后，用PBS將4T1細胞洗滌3次，加入培養(yǎng)基，用低強度聚焦超聲處理。24 h 后，用CCK 8 試劑檢測5 組4T1細胞的增殖情況。

1.2.9 細胞劃痕實驗 將帶熒光的4T1細胞分為5組。①對照組：不作處理。②單獨超聲組：用低強度聚焦超聲處理。③傳統(tǒng)給藥組：將4T1 細胞與PLGA-DOX 孵育6 h。④細胞外釋藥組：低強度聚焦超聲處理PLGA-DOX 納米氣泡后，將4T1細胞與經(jīng)預處理的PLGA-DOX 一起培養(yǎng)6 h，用PBS 洗3遍，加入培養(yǎng)基。⑤細胞內(nèi)釋藥組：在用PLGADOX 與細胞孵育6 h 后，用PBS 將4T1 細胞洗滌3次，加入培養(yǎng)基，用低強度聚焦超聲處理。24 h后，進行劃痕拍照。實驗獨立重復3 次。用ImageJ 軟件對0 h 及24 h 的圖片進行如下操作：Process，Enhance Contrast，勾 上Normalize，Saturated pixels：0.3%，點擊OK，然后Process，Smooth（平滑），Process，F(xiàn)ind Edges（尋找邊緣），Image，Adjust，Threshold，閾值選定，選中為紅色，調(diào)節(jié)閾值為0-20。點擊Apply。然后選擇魔棒工具選擇劃痕沒有細胞覆蓋的部分，Analyze，Measure，并測出沒有被細胞覆蓋的劃痕像素面積。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，超聲最佳參數(shù)、流式檢測細胞死亡的生存率以及劃痕像素面積采用單因素方差分析（one way ANOVA），且行Boneferroni 校正的t檢驗進行組間比較；CCK 8 細胞活力采用Welch's ANOVA 分析；體外釋藥用重復測量方差分析；攝取的細胞活性及平均熒光強度采用兩獨立樣本t檢驗。當P＜0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA-DOX的表征

掃描電子顯微鏡顯示PLGA-DOX 是球形的，大小相對均勻（圖1 A），測得PLGA-DOX 顆粒的水合粒徑為（565.40±8.00）nm（圖1 B），電位為（-8.53±0.40）mV，載藥量為（4.41±0.13）%。

圖1 PLGA-DOX表征Fig.1 Characterization of PLGA-DOX

2.2 PLGA-DOX的最佳超聲參數(shù)及IC50

數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=1.171，P=0.305），在1 W（103.07±6.84）%比（100.00±11.35）%，P=0.969，和2 W（98.42±10.13）%比（100.00±11.35）%，P=0.997 的聲強下，對細胞的增殖無影響，在3 W（71.48±4.17）%比（100.00±11.35）%，P＜0.001及4 W（64.11±5.47）%比（100.00±11.35）%，P＜0.001 的聲強下，對細胞的增殖有影響（F=30.453，P＜0.001），因此選擇2 W 的聲強為最優(yōu)參數(shù)（圖2 A）。通過GraphPad 的曲線擬合，得出了PLGA-DOX 的IC50濃度為0.85 mg/mL（圖2 B）。

圖2 PLGA-DOX的最佳超聲參數(shù)及IC50Fig.2 The best ultrasound parameters and IC50 of PLGA-DOX

2.3 4T1細胞對PLGA-DOX的攝取率

如圖所示，在0 h，4T1 細胞基本不攝取PLGAFITC，并且沒有觀察到綠色熒光。1 h 內(nèi)攝?。?3.30±2.70）%，開始出現(xiàn)熒光。3 h 的攝取量增加到（43.20±2.70）%，綠色熒光也增加了。在6、12、24 h，攝取量分別逐漸增加至（65.30±1.90）%，（71.20±2.20）%和（94.40±2.20）%。4T1 細胞對納米泡的攝取隨時間增加而增加。在最初的6 h內(nèi)，4T1細胞胞吞納米氣泡較快的。從6～12 h，4T1 細胞的攝取率沒有顯著變化。在24 h 內(nèi)，4T1 細胞對納米氣泡的吸收基本達到飽和。而在0、1、3、6、12和24 h 的細胞活性分別為（98.58±9.77）%、（98.87±9.55）%、（95.90±9.68）%、（98.46±1.91）%、（65.69±3.91）%、（32.09±6.02）%，數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=1.390，P=0.304）。其中在12、24 h 的PLGADOX 對細胞活性的影響是有統(tǒng)計學意義的分別為（t=9.023，P＜0.001；t=16.494，P＜0.001；圖3）。因此在6 h 的時間點，是對各組細胞處理比較好的時間點，因為時間點比較短，而這時細胞攝取了比較多的納米泡并且對細胞的活性沒有明顯影響，不影響后續(xù)的處理。

2.4 低強度聚焦超聲作用細胞內(nèi)空化的結(jié)果

圖3 4T1細胞攝取率Fig.3 Uptake rate of PLGA-FITC by 4T1 cells

攝取PLGA-DOX-FITC 后，細胞顯示綠色熒光。超聲組細胞核的紅色熒光平均強度高于對照組（51.90±3.18）比（20.05±0.93），數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=3.419，P=0.138），（t=16.627，P＜0.001；圖4 A）。細胞內(nèi)的PLGA-DOX-FITC 在低強度聚焦超聲作用下，細胞核的核膜出現(xiàn)破壞，而沒有超聲作用的條件下細胞核的核膜是正常的雙層膜結(jié)構(gòu)，說明低強度聚焦超聲處理后，PLGA-DOX-FITC 在細胞內(nèi)空化，導致細胞核的核膜破壞，通透性增加，同時阿霉素更多地釋放出來，進入細胞核內(nèi)，進而細胞核內(nèi)的阿霉素顯示紅色（圖4 C、D）。Hoechst染色的細胞核呈藍色?？梢钥闯鰣D中有更多的紅色和藍色重疊。相比之下，對照組釋放的阿霉素較少，所以染色淡。結(jié)果表明，低強度聚焦超聲處理可以使PLGA-DOX 在細胞內(nèi)空化增強細胞內(nèi)藥物的釋放效果。

2.5 低強度聚焦超聲作用PLGA-DOX的釋藥結(jié)果

PLGA-DOX 在3、5、7、24 和48 h 的累計釋藥量超聲組均高于對照組，分別為：［（39.36±2.07）%比（29.41±5.52）%，P＜0.001］、［（48.99±2.97）% 比（37.31±5.64）%，P＜0.001］、［（57.24±4.74）% 比（43.89±5.61）%，P＜0.001］、［（63.88±6.68）% 比（46.75±5.84）%，P＜0.001］、［（70.68±8.51）% 比（50.34±5.49）%，P＜0.001］（主體間效應：F=30.893，P＜0.001；主體內(nèi)效應：F=881.239，P＜0.001；交互效應：F=23.058，P＜0.05；圖4 B）。說明，低強度聚焦超聲作用可以增強PLGA-DOX 的藥物釋放。隨時間的延長，其釋藥也會增加，并且低強度聚焦超聲與時間因素有相互作用的效果，兩者都有增強釋藥的效果。

2.6 流式檢測細胞死亡的結(jié)果

流式分析細胞死亡：對照組，單純超聲組，傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組的細胞存活率分別為（93.90±3.50）%、（93.50±3.40）%、（77.37±2.65）%、（73.73±1.51）%、（59.90±1.38）%，數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=2.210，P=0.141），其中單純超聲組與對照組差異無統(tǒng)計學意義，說明單獨的低強度聚焦超聲作用對細胞的死亡無影響。傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組均與對照組差異有統(tǒng)計學意義，且細胞內(nèi)釋藥組與其他各組差異也均有統(tǒng)計學差異，（F=239.175，P＜0.001）。這說明低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥能夠比低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞外釋藥及傳統(tǒng)給藥組更能殺傷4T1腫瘤細胞（圖5 A、C）。

圖4 超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥Fig.4 Ultrasound-triggered intracellular drug release

2.7 CCK 8檢測細胞活力的結(jié)果

CCK 8檢測4T1細胞的增殖活力：對照組，單純超聲組，傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組的細胞的細胞增殖活力分別為（100.00±7.03）%，（95.26±10.41）%，（56.32±5.18）%，（51.51±4.65）%，（37.35±1.90）%，數(shù)據(jù)正態(tài)分布但方差不齊（F=3.751，P=0.016）。單純超聲組與對照組差異無統(tǒng)計學意義，說明低強度聚焦超聲單獨作用對4T1 乳腺腫瘤細胞的增殖活力沒有影響，與流式檢測細胞死亡的結(jié)果相符。傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組均與對照組的差異有統(tǒng)計學差異，并且細胞內(nèi)釋藥組與其他組均有統(tǒng)計學差異（F=2.992，P＜0.05，圖5 B），說明低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥能夠比低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞外釋藥及傳統(tǒng)給藥組更能殺傷4T1 腫瘤細胞，這與流式檢測細胞死亡的結(jié)果相符。

2.8 劃痕實驗的結(jié)果

劃痕的像素面積：在0 h，對照組、單純超聲組、傳統(tǒng)給藥組、細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組的劃痕像素面積（單位為DPI）分別為：（2 046 626.00 ±50 406.02）、（2 188 029±159 023.95）、（2 185 247.30±77 130.76）、（2133802.70±45 970.91）、（2 112 886.30±69 619.24），數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=3.436，P=0.052）。單純超聲組，傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組均與對照組無統(tǒng)計學差異。說明在處理前各組的劃痕面積（單位為DPI）無差異（F=1.254，P=0.350）。在24 h，對照組、單純超聲組、傳統(tǒng)給藥組、細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組的劃痕像素面積分別為：（261 842.67±6 388.90）、（317 079.33±15 607.32）、（1 093 205.70±83 282.69）、（1 592 005.70±64 333.96）、（2 936 746.30±121 529.56），數(shù)據(jù)正態(tài)分布且方差齊（F=3.345，P=0.055）。單純超聲組與對照組差異無統(tǒng)計學差異，說明單獨的低強度聚焦超聲對4T1 細胞的侵襲能力無影響，與流式檢測細胞死亡的結(jié)果及CCK8 的結(jié)果相符。傳統(tǒng)給藥組，細胞外釋藥組和細胞內(nèi)釋藥組均與對照組差異有統(tǒng)計學意義，細胞內(nèi)釋藥組與其他各組差異均有統(tǒng)計學差異（F=693.634，P＜0.001；圖6）。說明低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥能夠比低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞外釋藥及傳統(tǒng)給藥組更能殺傷4T1 腫瘤細胞，這與流式檢測細胞死亡的結(jié)果及CCK 8的結(jié)果相符。

圖5 細胞死亡評價Fig.5 Evaluation of cell death

圖6 不同處理對4T1細胞在體外遷移的影響Fig.6 Effect of different treatments on 4T1 cell migration in vitro

3 討論

由于PLGA 的聲學特性取決于超聲能量的動態(tài)變化，因此PLGA 納米氣泡作為超聲造影劑和靶向藥物輸送載體已經(jīng)進行廣泛研究了［17-18］。同時，阿霉素是常用化療藥物之一，且效果肯定。我們選擇PLGA 作為阿霉素的載體，是因為它是最有希望的生物材料之一，它可以在體內(nèi)自然降解和代謝，并且毒性最小。同時，它也是控制和持續(xù)釋放封裝藥物的良好載體。盡管普遍接受超聲可以控制藥物釋放，但是關(guān)于超聲如何控制細胞內(nèi)藥物釋放的研究很少。因此，在本研究中，我們以PLGA 為載體，將阿霉素包裹在PLGA 納米顆粒中，構(gòu)建PLGA-DOX 藥物遞送系統(tǒng)，并成功實現(xiàn)了藥物的細胞外釋放，同時實現(xiàn)了細胞內(nèi)釋放。在實驗結(jié)果中，可以看出細胞內(nèi)藥物釋放可以進一步增強4T1腫瘤細胞的死亡。

超聲靶向微泡破壞技術(shù)所致的空化效應使細胞膜上出現(xiàn)可逆性或不可逆性小孔，提高了細胞膜的通透性，從而利于藥物的遞送［29］。通過超聲將藥物遞送至腫瘤，并且用超聲使靜脈內(nèi)微泡爆破治療腫瘤，這些研究證明是可行的［31-33］。正如前所述，這些藥物在血管內(nèi)皮細胞中釋放并損害腫瘤血管，這些血管的損傷可能減少藥物的攝入并引起正常器官的毒性。在這項研究中，我們通過細胞內(nèi)空化，使超聲介導的空化效應在細胞內(nèi)產(chǎn)生，使藥物進入細胞核內(nèi)，通過制備PLGA-DOX 納米氣泡，驗證了低強度聚焦超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)藥物釋放比超聲觸發(fā)的細胞外藥物釋放更能誘導4T1 細胞死亡，抑制4T1 細胞侵襲。我們?yōu)榈蛷姸染劢钩曉诩毎麅?nèi)空化增強細胞內(nèi)藥物釋放和抗癌功效的應用提供概念驗證。這種方式將對基于PLGA-DOX 納米氣泡的乳腺癌靶向治療進一步體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

本研究是在細胞水平上研究的。在動物水平上還沒進行深入的研究，關(guān)于如何在動物體內(nèi)的超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥還沒進行嘗試，這是本研究的一個局限性，后續(xù)將在實現(xiàn)動物體內(nèi)超聲觸發(fā)的細胞內(nèi)釋藥等方面進行深入的研究。綜上所述，本研究成功制備了包裹DOX 藥物的PLGA 的納米顆粒，并實現(xiàn)了超聲控制的細胞內(nèi)藥物釋放。通過PLGA-DOX 與超聲控制的胞內(nèi)釋藥結(jié)合，進一步增強了4T1細胞的死亡和抑制4T1細胞侵襲。