外置磁場下靜脈注射經(jīng)SPIONs標記的Ngb轉(zhuǎn)染ADSCs靶向治療大鼠脊髓損傷的實驗研究

胡金金，齊新文，李松軍，王德偉，譚偉源

(遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519000)

目前因交通事故及高空作業(yè)增多而導致的脊髓損傷發(fā)生率不斷增加[1]，脊髓損傷后治療效果往往不佳，致殘率高，因勞動能力喪失給家庭及社會造成極大的經(jīng)濟負擔。目前脊髓損傷的治療方式主要分為傳統(tǒng)治療和基因治療兩類。傳統(tǒng)治療方法主要包括椎體后路減壓、激素沖擊治療、高壓氧療法等，這些方式能不同程度地緩解脊髓損傷部位的病理改變，但對損傷神經(jīng)再生均無明顯效果[2-3]。近年來，隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展及完善，將目的基因通過病毒載體轉(zhuǎn)染至脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的技術(shù)越來越成熟，ADSCs的定向歸巢機制能將目的基因攜帶至損傷部位進行表達從而給脊髓損傷的治療帶來新的希望[4]。腦紅蛋白(neumglobin,Ngb)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性的攜氧珠蛋白，是一種信號轉(zhuǎn)導調(diào)控因子及內(nèi)源性神經(jīng)保護因子[5-6]。研究表明，Ngb對神經(jīng)細胞的缺氧損傷、氧化應(yīng)激損傷具有很好的神經(jīng)保護作用[7]。ADSCs是一種具有自我修復(fù)及多向分化能力的干細胞，在特定環(huán)境下可以誘導ADSCs向多種細胞(內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、平滑肌細胞等)分化[8-9]。ADSCs具有提取方便、分離簡單、培養(yǎng)及傳代操作容易等優(yōu)點，目前已成為干細胞研究的理想細胞來源[10]。因此，本研究將Ngb基因通過慢病毒轉(zhuǎn)染至ADSCs治療大鼠脊髓損傷并觀察評估治療效果是否存在疊加效應(yīng)，為臨床治療脊髓損傷提供新思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 ①實驗動物：SPF級SD大鼠36只，雌雄不均，12周齡，體重(230±20)g,均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。動物飼養(yǎng)條件：每個鼠籠6只，群養(yǎng)，采用10 h∶14 h晝夜間斷照明模式。飼養(yǎng)溫度(24±2)℃，濕度(50±10)%，喂以鼠專用全價顆粒飼料(9.3～18.5 g/d),飲水瓶自由進純凈水(20～45 mL/d)。②主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購買自美國Life Technologies公司；4%多聚甲醛、0.1% Ⅰ型膠原酶溶液、0.25%胰蛋白酶及水合氯醛顆粒均購自合肥博美生物科技有限公司；超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)購自上海羧菲生物醫(yī)藥科技公司；抗Ngb單克隆抗體(批號：ab108937)購自美國Abcam公司；硝酸纖維素膜(批號：FFN02)及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(批號：P0015L)均購自江蘇碧云天公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠制備試劑盒(批號：P12002)購自美國Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1動物ADSCs的提取傳代、Ngb轉(zhuǎn)染及SPIONs標記ADSCs 任取12周齡的健康大鼠1只，從其腹股溝脂肪組織中提取ADSCs，細胞培養(yǎng)傳代至第三代，將培養(yǎng)好的ADSCs通過離心濃縮凍存，外送凍存的ADSCs至廣州杰特偉生物科技公司，成功構(gòu)建 Ngb基因慢病毒表達載體pLenti.NgbIRES-EGFP(PLentiviral.Neuroglobin Internal Ribosome Entry Site-Enhanced Green Fluorescent Protein)，再用SPIONs分別標記ADSCs與Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs。

1.2.2動物造模分組及給藥 36只SD大鼠造模前脊髓損傷行為學BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分均為21分，用改良Allen′s法造模后BBB評分均為0分，采用隨機數(shù)字法將造模成功后的SD大鼠分為空白對照組、干細胞組及轉(zhuǎn)染干細胞組，每組12只,實驗過程中出現(xiàn)死亡大鼠均用備用大鼠造模成功后替代。空白對照組尾靜脈注射DMEM高糖培養(yǎng)基0.3 mL,共1周；干細胞組尾靜脈注射含有細胞密度1×107/mL ADSCs培養(yǎng)液0.3 mL，共1周；轉(zhuǎn)染干細胞組尾靜脈注射含有細胞密度1×107/mL Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs培養(yǎng)液0.3 mL，共1周。

1.2.3BBB評分 實驗開始后的第1、3、5、7、14、28天分別對各組脊髓損傷大鼠行BBB評分，評分小組由3名本科室成員組成，每只大鼠的評分為3人評分的平均值。

1.2.4損傷脊髓組織蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色) 第28天BBB評分結(jié)束后立即處死所有實驗大鼠并提取損傷處脊髓組織，每組12份樣本，共36份樣本，然后從空白組、干細胞組及轉(zhuǎn)染干細胞組中隨機各選取4份樣本進行固定12 h后，脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度4 μm，進行HE染色觀察損傷處脊髓組織改變情況。

1.2.6透射電鏡觀察 將每組剩余的4份樣本脊髓組織進行固定6 h、脫水、包埋、固化、切片(厚度50～60 nm)、3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色、透射電鏡觀察、拍片。

2 結(jié) 果

2.1動物造模 采用改良Allen′s法造模，整個實驗過程中空白對照組大鼠死亡2只，干細胞組大鼠死亡3只，轉(zhuǎn)染干細胞組死亡2只，死亡均出現(xiàn)在第3天后，考慮脊髓損傷后大小便潴留致感染導致死亡。見圖1。

1a:打開椎板暴露脊髓；1b:造模后雙下肢完全癱瘓

2.2各組脊髓損傷大鼠BBB評分比較 在損傷后的第1天、第3天，各組大鼠BBB評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第5天、7天、14天、28天，各組大鼠BBB評分比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，干細胞組和轉(zhuǎn)染干細胞組BBB功能評分均高于空白對照組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染干細胞組BBB評分高于干細胞組(P<0.05)，見表1。

表1 各組脊髓損傷大鼠BBB評分比較

2.3HE染色 空白對照組組織排列紊亂，膠質(zhì)瘢痕，神經(jīng)元空泡樣及囊腔改變明顯；干細胞組組織排列更加規(guī)則，神經(jīng)元空泡樣及囊腔樣改變明顯較前者少，單位面積內(nèi)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量增多；轉(zhuǎn)染干細胞組組織排列規(guī)則，膠質(zhì)纖維形成少，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量較多，神經(jīng)元空泡樣及囊腔樣改變較少，見圖2。

2a:空白對照組；2b：干細胞組；2c：轉(zhuǎn)染干細胞組

2.4各組損傷脊髓組織Ngb相對表達水平比較 空白對照組、干細胞組、轉(zhuǎn)染干細胞組Ngb表達水平分別為(0.14±0.04)mg/kg、(0.38±0.11)mg/kg、(0.72±0.05)mg/kg，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=183.541,P<0.001)，其中干細胞組、轉(zhuǎn)染干細胞組高于空白對照組(P<0.05)，轉(zhuǎn)染干細胞組高于干細胞組(P<0.05)。見圖3。

Ngb：腦紅蛋白；A：空白對照組；B：干細胞組；C：轉(zhuǎn)染干細胞組

2.5各組損傷脊髓組織電鏡檢查結(jié)果 空白對照組神經(jīng)組織脫髓鞘病變嚴重，部分髓鞘消失，神經(jīng)膠質(zhì)細胞核固縮改變嚴重，部分神經(jīng)元細胞溶解，神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞數(shù)量及突觸小泡數(shù)量極少；干細胞組神經(jīng)髓鞘板層結(jié)構(gòu)連續(xù)清楚，新生神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)清楚且包裹神經(jīng)纖維，突觸間隙存在，突觸小泡數(shù)量進一步增多；轉(zhuǎn)染干細胞組可見新髓鞘及軸突形成明顯增多，突觸間隙清晰，神經(jīng)元細胞及突觸小泡數(shù)量明顯增多。見圖4。

4a:空白對照組；4b：干細胞組；4c：轉(zhuǎn)染干細胞組

3 討 論

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，制作高度契合的模型對治療脊髓損傷的研究至關(guān)重要，目前常用的模型制作方法主要包括傳統(tǒng)Allen′s法[11]、改良Allen′s法[12]、電磁打擊法[13]等，改良Allen′s法具有操作簡單，價廉、學習時間短及與脊髓損傷相似度高等優(yōu)點[14]，同時能制備出可靠性和重復(fù)性更高的脊髓損傷動物模型。故本研究選擇改良的Allen′s法進行實驗SD大鼠造模，通過BBB評分來反映雙下肢神經(jīng)功能情況，所有大鼠造模后BBB評分均為0分，證明造模成功，同時也說明這種造模方式成功率高且造模效果理想。

近年來，各種不同干細胞被廣泛用于血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究，自體來源的ADSCs具有數(shù)量多、操作方便、便于提取等優(yōu)勢，ADSCs在特定的環(huán)境下可以被誘導向多種細胞(內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、施萬細胞等)分化[15-16]，ADSCs定向分化形成的神經(jīng)細胞對大鼠脊髓損傷具有修復(fù)作用。Zhang等[17]在體外實驗中將ADSCs置于神經(jīng)誘導培養(yǎng)基中生長分化，然后聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子-3移植到脊髓損傷部位，實驗檢測到損傷局部組織內(nèi)神經(jīng)元細胞數(shù)量增多、突觸小泡和神經(jīng)髓鞘形成增加，一定程度上證明了ADSCs能夠向神經(jīng)元細胞分化的能力，同時還能促進突觸及神經(jīng)髓鞘的再生。本實驗中3組大鼠在28 d分別進行了脊髓損傷局部組織的HE染色，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷大鼠組織中神經(jīng)元空泡樣改變和囊腔樣改變程度不同，轉(zhuǎn)染干細胞組低于干細胞組，干細胞組低于空白對照組，其次在第28天分別對各組大鼠脊髓損傷部位行透射電鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染干細胞組神經(jīng)細胞、突觸及神經(jīng)髓鞘等數(shù)量最多，干細胞組其次，空白對照組最少，表明干細胞有向神經(jīng)細胞分化的可能性，從而對大鼠脊髓損傷起到修復(fù)作用。

Ngb是被發(fā)現(xiàn)的第三種攜氧珠蛋白，與神經(jīng)系統(tǒng)組織氧供有密切關(guān)系，它不僅是一種攜氧球蛋白，也是一種氧感受器[7,18]。Luyckx等[19]研究不同區(qū)域腦組織在缺血條件下腦損傷的嚴重程度，結(jié)果顯示Ngb在大腦皮質(zhì)中的水平遠高于海馬組織，達4倍左右，證實了Ngb表達水平高低與該區(qū)域神經(jīng)元對缺血、缺氧的耐受性呈正相關(guān)。同時，Ngb能夠作為氧傳感器，發(fā)揮調(diào)節(jié)信號通路，減弱氧化應(yīng)激，保持線粒體功能的作用[20]。本實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干細胞組Ngb表達水平明顯高于干細胞組；同時轉(zhuǎn)染干細胞組的大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較干細胞組好，表明Ngb有利于促進大鼠脊髓損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)，對大鼠脊髓損傷神經(jīng)有一定修復(fù)作用。

綜上所述，靜脈注射Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs能夠靶向遷移到脊髓損傷部位，同時Ngb能在脊髓損傷部位表達，減輕脊髓損傷局部的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對大鼠脊髓損傷發(fā)揮一定治療作用。ADSCs具有多向分化能力，可以促進神經(jīng)功能恢復(fù)，ADSCs及Ngb均對大鼠脊髓損傷有效，而Ngb轉(zhuǎn)染的ADSCs治療脊髓損傷的效果更佳。