Bex1和NF?kBp65在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

王倩倩， 丁丹丹， 丁翔， 韓瑞， 韓影影， 周美云， 徐錦程

1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠（233004）； 2. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠（233000）

舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔鱗狀細(xì)胞癌中最常見的類型，男性多于女性，但近年來有女性發(fā)病增多及發(fā)病年齡年輕化的趨勢(shì)［1］。雖然TSCC 的診斷和治療水平有所提高，但其預(yù)后仍較差，且局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是TSCC 患者預(yù)后較差的主要原因［2］。核因子?kB（nuclear factor kappa B，NF?kB）是真核細(xì)胞中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，以p65/p50二聚體為中心的NF?kB 異?；罨谀[瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移及抗凋亡機(jī)制中發(fā)揮重要作用［3?4］。腦表達(dá)的X 連鎖基因1（brain expressed X?linked gene 1，Bex1）是Bex 家族的成員，近年來有研究發(fā)現(xiàn)Bex 參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等重要的病理生理過程及一些癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。Lee 等［5］曾報(bào)道Bex1 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，但Bex1 和NF?kB 與TSCC 臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的研究較少。本文采用免疫組化法檢測(cè)Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為TSCC 的診斷和治療提供有價(jià)值的參考。

1 資料和方法

1.1 基本資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科2012 年1 月至2014 年12 月經(jīng)手術(shù)切除且病理證實(shí)為TSCC 的保持完整的石蠟組織標(biāo)本60 例。所有患者術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者轉(zhuǎn)至放療科放療等。年齡36～82 歲，中位年齡62 歲，男性41 例，女性19 例。高分化者33 例，中分化15 例，低分化12 例。腫瘤直徑＜2.0 cm 者21 例，2～4 cm 者25 例，＞4 cm 者14 例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）2010 年版對(duì)臨床分期進(jìn)行劃分：Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期26 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19 例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目為1～3 枚者13 例，4 枚以上者6 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41 例。同時(shí)選擇60 例癌旁正常上皮組織作為對(duì)照組。所有患者均進(jìn)行電話隨訪，術(shù)后1 年內(nèi)每3 個(gè)月隨訪1 次，術(shù)后第2 年每6個(gè)月隨訪1 次，從術(shù)后第3 年起每1 年隨訪1 次，共隨訪5 年。

1.2 主要試劑

兔抗人Bex1 和NF?kBp65 抗體、羊抗兔二抗均購自南京邁克沃德生物科技有限公司；DAB 顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化

所有石蠟組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm 連續(xù)切片，脫蠟，高壓抗原修復(fù)等，采用EliVision 法行免疫組織化學(xué)染色。一抗Bex1、NF?kBp65 稀釋比例均為1∶300，一抗用PBS緩沖液代替作為陰性對(duì)照，TSCC 陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果評(píng)判

免疫組化結(jié)果由2位高年資病理科醫(yī)師在雙盲下閱片并記錄。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)獨(dú)立高倍視野，計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①細(xì)胞著色強(qiáng)度，無著色或弱，0 分；淡黃色，1 分；棕黃色，2分；棕褐色：3 分；②染色陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，＜5%，0分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；＞50%，3分。總評(píng)分將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0 軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)；單因素生存分析用Kaplan?Meier 生存曲線和Log rank 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bex1 和NF?kBp65 蛋白在TSCC 和癌旁正常上皮組織中的表達(dá)

Bex1 和NF?kBp65 主要染色于細(xì)胞漿，后者部分細(xì)胞核中也可見陽性染色，所有蛋白的陽性表達(dá)均呈棕黃色或棕褐色（圖1），Bex1 在TSCC 組織中低表達(dá)，NF?kBp65 在TSCC 組織中高表達(dá)。兩者在TSCC 組織和癌旁組織中的陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

Figure 1 Immunohistochemical examination of Bex1 and NF?kBp65 expression in TSCC and adjacent normal tongue tissues（×200）圖1 Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 和癌旁正常舌組織中表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)（×200）

表1 TSCC 和癌旁正常組織中Bex1、NF?kBp65 的表達(dá)Table 1 The expression of Bex1 and NF?kBp65 in TSCC tissues and adjacent normal tissues n（%）

2.2 Bex1 和NF?kBp65 與TSCC 臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，Bex1 的陽性表達(dá)率與腫瘤直徑、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)均無關(guān)（P＞0.05）。NF?kBp65 的陽性表達(dá)率與TNM 分期、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑均無關(guān)（P＞0.05），見表2。

2.3 Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中表達(dá)的相關(guān)性

根據(jù)相關(guān)性分析顯示，Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r＝?0.302，P＝0.019），見表3。

2.4 生存分析

Kaplan?Meier 生存分析顯示NF?kBp65 陽性表達(dá)與TSCC 患者的生存率無關(guān)（P＝0.674）；Bex1 陽性表達(dá)的TSCC 患者平均生存時(shí)間為56 個(gè)月，而Bex1 陰性表達(dá)的TSCC 患者平均生存時(shí)間為42 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)果表明，Bex1 陽性表達(dá)的TSCC 患者生存率明顯高于陰性表達(dá)者（圖2）。

3 討 論

人腦表達(dá)X 連鎖Bex 家族由Bex1、Bex2、Bex3、Bex4、Bex5 五個(gè)成員組成，位于染色體Xq22 區(qū)域，Bex1 和Bex2 在C 末端附近包含一個(gè)保守的基序Ser?Leu?Arg，該基序被蛋白激酶C 磷酸化，蛋白激酶C 由10 個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，與許多癌癥相關(guān)［6?8］。Bex 蛋白參與神經(jīng)變性、癌癥、細(xì)胞周期和腫瘤生長所涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號(hào)通路，并在一些惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)。Bex1 在肺腺癌中參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移并且與患者不良預(yù)后有關(guān)［9］；Bex1 在食管鱗狀細(xì)胞癌中的低表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床預(yù)后不良相關(guān)，是影響總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bex1 可能通過NF?kB 信號(hào)通路抑制食管癌的增殖和生長而發(fā)揮抑癌作用［10］；在顱內(nèi)室管膜瘤中存在啟動(dòng)子高甲基化使Bex1 表達(dá)下調(diào)，而Bex1 過表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖［11］；Bex1 在伴有混合系白血病突變的急性髓系白血病中高表達(dá)，推測(cè)其可能起癌基因的作用［12］；Bex1 在一組FMS 樣絡(luò)氨酸激酶?3 驅(qū)動(dòng)的急性白血病等疾病中表達(dá)下調(diào)等［13］。本研究結(jié)果顯示，Bex1 主要染色于細(xì)胞漿，在TSCC 中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，且與腫瘤直徑、TNM 分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，Kaplan?Meier 生存分析顯示Bex1 陽性表達(dá)患者的預(yù)后明顯優(yōu)于陰性表達(dá)患者，表明Bex1 可能參與了TSCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移，與TSCC 患者的不良預(yù)后有關(guān)。

表2 TSCC 中Bex1、NF?kBp65 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of Bex1 and NF?kBp65 in TSCC and clinicopathologic features of patients with TSCC n（%）

表3 TSCC 中Bex1 和NF?kBp65 表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation of Bex1 and NF?kBp65 expression in TSCC

Figure 2 Kaplan?Meier survival curves of Bex1?positive and Bex1?negative TSCC patients圖2 Bex1 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)TSCC 患者Kaplan Meier 生存曲線

NF?kB 包括5 個(gè)多肽鏈亞基，其中p65 是NF?kB的主要功能蛋白，能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能。以p65 亞基磷酸化為特征的NF?kB 活化在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3］。p65異常活化是NF?kB 通路激活的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，仍然是目前的研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，NF?kBp65 在TSCC 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，主要染色于細(xì)胞漿，部分細(xì)胞核中出現(xiàn)陽性染色，且隨著TNM 分期增加，組織學(xué)分級(jí)越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NF?kBp65的表達(dá)越強(qiáng)，與蔣麗蘭等［14］的研究結(jié)果一致。提示NF?kBp65 的異?；罨赥SCC 的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能起重要的促進(jìn)作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Bex 家族成員與NF?kB 通路之間有緊密聯(lián)系，Bex1 的過表達(dá)對(duì)NF?kB 的活性有顯著抑制作用［15］。本研究結(jié)果也表明Bex1、NF?kBp65 在TSCC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示NF?kB 信號(hào)通路可能參與了Bex1 促進(jìn)TSCC 的增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)相較于癌旁組織，TSCC中Bex1 陽性表達(dá)率低，NF?kBp65 陽性表達(dá)率高，其表達(dá)水平與TSCC 的發(fā)展有關(guān)，提示兩者可能與TSCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kaplan?Meier 生存分析結(jié)果顯示Bex1 陽性表達(dá)的平均生存時(shí)間長于陰性表達(dá)者，Bex1 的表達(dá)與患者的生存率有關(guān)，提示Bex1 對(duì)TSCC 的預(yù)后有一定的影響。本研究?jī)H在組織學(xué)水平驗(yàn)證了Bex1 和NF?kBp65 在TSCC 中的表達(dá)和相關(guān)性分析，而Bex1 是如何通過NF?kB 信號(hào)通路促進(jìn)TSCC的增殖的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。