川烏、白芍治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

樊梅 唐芳 馬武開 蘭維婭 李宇 蔣總 蔡鑫 金澤旭

【摘 要】目的：研究川烏、白芍治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為指標(biāo)，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫分別獲取川烏、白芍的活性成分、作用靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建川烏、白芍活性成分?作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，采用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（String 10.0）構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最后通過基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析川烏、白芍防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。結(jié)果：共得到川烏、白芍97個活性成分，涉及1041個作用靶點(diǎn)，通過篩選得出16種活性成分，檢索到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)3797個，其中川烏、白芍和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的共有靶點(diǎn)34個，參與的KEGG通路有AGE-RAGE、白細(xì)胞介素（IL）-17、腫瘤壞死因子（TNF）、Toll樣受體、p53、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（FOXO）、JAK-STAT、活化PI3K-Akt、核轉(zhuǎn)錄因子-κB等信號通路。結(jié)論：川烏、白芍可能通過IL-6、蛋白激酶、絲裂原活化蛋白激酶等靶點(diǎn)作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll樣受體、p53、FOXO等等多項細(xì)胞因子及多條信號通路發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，提示川烏、白芍多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征，對未來研究川烏、白芍治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;川烏;白芍;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號通路

Network Pharmacology of Chuanwu and Baishao in the Treatment of Rheumatoid Arthritis

FAN Mei，TANG Fang，MA Wu-kai，LAN Wei-ya，LI Yu，JIANG Zong，CAI Xin，JIN Ze-xu

【ABSTRACT】Objective：To study the mechanism of Chuanwu（Radix Aconiti）and Baishao（Radix Paeoniae Alba）in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：According to the indexes of OB≥ 30% and DL ≥ 0.18，the active components and targets of Chuanwu and Baishao were obtained by TCMSP database，and the rheumatoid arthritis targets were obtained by GeneCards database，software 3.7.2 was used to construct the protein-protein interaction（PPI）network，and finally，the mechanism of them in the prevention and treatment of rheumatoid arthritis was analyzed by Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of genes and genomes（KEGG）pathway enrichment.Results：A total of 97 active components of Chuanwu and Baishao were obtained，involving 1041 targets.Through screening，16 active components were obtained，and 3797 targets of rheumatoid arthritis were retrieved，including 34 targets of Chuanwu，Baishao and rheumatoid arthritis.

AGE-RAGE，IL-17，TNF，Toll-like receptor，p53，F(xiàn)OXO，JAK-STAT，activation of P13K-Akt，nuclear factor-κB and other signaling pathways involved in KEGG.Conclusion：Chuanwu and Baishao may be related to IL-6 and protein kinase，mitogen activated protein kinase and other targets act on AGE-RAGE，IL-17，TNF，toll like receptor，p53，F(xiàn)OXO and other cytokines and multiple signaling pathways to play a role in the treatment of rheumatoid arthritis，suggesting that Chuanwu and Baishao have the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel， which is of great significance for the future study of Chuanwu and Baishao in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;Chuanwu;Baishao;network pharmacology;signal pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，以侵蝕性、對稱性關(guān)節(jié)炎為特征，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和功能喪失，是世界范圍內(nèi)致殘的主要原因之一，其基本病理改變?yōu)榛ぱ准把荇栊纬?，發(fā)病機(jī)制目前尚不甚明了[1]。RA的治療主要依賴于改善病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、中草藥和生物制劑等。中草藥治療RA歷史悠久[2]，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑和注重整體的優(yōu)點(diǎn)，治療作用明顯[3]。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，年老體虛、正氣不足，風(fēng)寒濕邪氣乘虛入里，痹阻關(guān)節(jié)筋脈是引起RA的主要病機(jī)。中醫(yī)治療RA所用的中藥較多[4]，白芍藥用部位為毛茛科植物芍藥的根，有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽等功效，主要用于治療疼痛病癥，白芍總苷為白芍的主要成分，能抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)[5]。川烏為毛茛科植物烏頭的干燥母根，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，其能祛風(fēng)除濕，可用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、麻醉止痛等，是中醫(yī)臨床的常用藥[6]。川烏、白芍配伍最早見于漢·張仲景《金匱要略》的烏頭湯，是治療風(fēng)寒濕痹證常用的藥對[7]，現(xiàn)在多用于治療RA，臨床運(yùn)用廣泛;但其藥效基礎(chǔ)及具體作用機(jī)制尚未明確，限制了其臨床運(yùn)用。因此，鑒于川烏、白芍有效成分的復(fù)雜性與多樣性，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究川烏、白芍治療RA的藥理機(jī)制建立了藥物與疾病間的網(wǎng)絡(luò)，以期為進(jìn)一步利用川烏、白芍治療RA提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 川烏-白芍化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中分別獲取川烏、白芍的化學(xué)成分，共搜集97個化合物。

1.2 口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中對川烏、白芍所有成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，主要以O(shè)B和DL為篩選條件。

1.3 藥物靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換和疾病靶點(diǎn)的篩選 通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所得藥物靶點(diǎn)ID轉(zhuǎn)換成GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）的基因名稱。以“rheumatoid arthritis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫收集和RA相關(guān)的基因。通過對RA相關(guān)基因和川烏-白芍靶基因的定位，獲得川烏、白芍治療RA的靶點(diǎn)。

1.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述步驟所得的共同靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建川烏-白芍藥對成分靶點(diǎn)-靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)，化合物節(jié)點(diǎn)度（degree）表示治療RA的化合物個數(shù)，重點(diǎn)對度值較大的化合物進(jìn)行分析。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了說明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將川烏-白芍與RA共同靶點(diǎn)基因，上傳到在線String 10.0軟件（https：//string-db.org/），選取分值 > 0.4的最高置信度數(shù)據(jù)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因所表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用R語言3.6.1軟件（https：//www.r-project.org/），繪制PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)繪的條形圖。

1.6 基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以闡明化合物的靶點(diǎn)蛋白，對基因功能及信號通路的影響。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選 選取TCMSP數(shù)據(jù)庫中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共篩選出16個活性化合物，如芍藥苷（paeoniflorin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、兒茶素（catechin）等。

2.2川烏、白芍活性成分-RA靶點(diǎn)相互作用韋恩圖 依據(jù)Z值 < -1.0標(biāo)準(zhǔn)，按分子-靶蛋白對接結(jié)果中篩選出相關(guān)靶蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)34個共同基因，確定為川烏、白芍治療RA的靶基因。見圖1。

2.3 川烏、白芍活性成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape 3.7.2建立川烏、白芍-RA的網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由40個節(jié)點(diǎn)，4個目標(biāo)節(jié)點(diǎn)，34個疾病節(jié)點(diǎn)和82個邊緣組成，其中紅色節(jié)點(diǎn)代表RA，紫色節(jié)點(diǎn)代表川烏、白芍，黃色節(jié)點(diǎn)節(jié)點(diǎn)代表川烏、白芍藥物活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表RA靶點(diǎn)，每條邊代表川烏、白芍與RA之間的相互作用關(guān)系。見圖2。其主要化合物有芍藥苷（paeoniflorin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、兒茶素（catechin）。

2.4 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析 PPI網(wǎng)絡(luò)由34個靶蛋白節(jié)點(diǎn)和225條相互作用的線組成。見圖3。其中白細(xì)胞介素（IL）-6（度值 = 27）、蛋白激酶（Akt1，度值 = 25）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8，度值 = 23）、胱天蛋白酶3（CASP3，度值 = 22）、JUN（度值 = 22）等具有較高的度值，它們與其他蛋白相互作用，并在網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。見圖4。

2.5 GO生物過程分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中，34個目標(biāo)基因在GO生物過程中富集，根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）< 0.05篩選出65個GO生物過程，見圖5?？梢奟A的發(fā)生、發(fā)展涉及蛋白質(zhì)活性、腫瘤壞死因子（TNF）活性、DNA和RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物過程，川烏、白芍可通過調(diào)控上述生物過程來治療RA。

2.6 KEGG信號通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫，將川烏和白芍的34個靶基因富集到KEGG信號通路中，并以FDR < 0.05為篩選條件，得出與RA密切相關(guān)的信號通路。包括AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll樣受體、p53、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（FOXO）、JAK-STAT、pI3k-Akt、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等115條信號通路，每條通路都有相應(yīng)的通路圖。推測川烏、白芍可能主要通過調(diào)控上述關(guān)鍵基因，通過影響上述信號通路達(dá)到治療RA的作用。

3 討 論

RA是一種進(jìn)行性關(guān)節(jié)損害的慢性炎癥性疾病，女性發(fā)病率高于男性，主要見于老年人，可導(dǎo)致進(jìn)行性殘疾、過早死亡和增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對稱性關(guān)節(jié)受累的臨床表現(xiàn)包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、發(fā)紅，甚至限制運(yùn)動范圍，除關(guān)節(jié)癥狀外，還可導(dǎo)致外部或內(nèi)臟損害，如類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、心、肺、腎、周圍神經(jīng)和眼睛等[8]。目前，RA常用的治療方法有手術(shù)治療、藥物治療和心理治療等，中醫(yī)藥在臨床上亦有特殊的治療作用[9]。中醫(yī)藥具有多化學(xué)成分、多藥理作用和多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)，傳統(tǒng)的研究方法難以完全解釋其作用機(jī)制。近年來，由生物信息學(xué)和藥理學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以清楚地闡明這類藥物的作用原理，系統(tǒng)解釋多組分藥物在疾病治療中的作用，通過找出藥物組分及靶點(diǎn)與疾病的關(guān)系，并將其抽象為網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型[10]。因此，筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究川烏、白芍對RA的治療作用，以期找到其藥用價值。

本研究中，RA與川烏、白芍相關(guān)的活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中包含34個靶點(diǎn)，其中，度值 > 20的靶點(diǎn)為IL-6、Akt1、MAPK8、CASP3、JUN、PTGS2、CAT，推測川烏、白芍有效成分可能通過上述靶點(diǎn)發(fā)揮作用。如PTGS2基因參與NF-κB信號通路的調(diào)控，在滑膜炎癥中具有很大的作用，調(diào)控炎癥、凋亡、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞因子與趨化因子的級聯(lián)反應(yīng)等，參與破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的生成和分化[11];IL-6作為一種多向性細(xì)胞因子，已被證明與RA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12]。

通過初步篩選，得出川烏、白芍治療RA的活性成分主要有4種，即芍藥苷、β-谷甾醇、山柰酚、兒茶素。研究表明，芍藥苷能改善RA相關(guān)通路上的炎癥、代謝和免疫反應(yīng)等，可作為治療RA的潛在藥物[13];β-谷甾醇是植物和蔬菜的主要成分，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，有望成為RA治療的有效藥物之一[14];一項分子對接研究表明，山柰酚可以通過相關(guān)通路抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制活化的T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子如IL-17、IL-21和TNF-α的釋放[15];兒茶素可以不同程度地干擾IL-1β信號通路的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎的作用[16]。

從通路富集結(jié)果分析可知，川烏、白芍主要通過影響以下通路發(fā)揮治療RA的作用：AGE-RAGE、IL-17、TNF、Toll樣受體、p53、FOXO、JAK-STAT、pI3k-Akt、NF-κB等115條信號通路。如AGE-RAGE信號通路在骨骼中有一定的作用，包括增強(qiáng)成骨功能[17];IL-17或TNF-α均能處理RA滑膜細(xì)胞，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，參與滑膜細(xì)胞的遷移、侵襲及關(guān)節(jié)破壞[18];IL-17在RA成纖維樣滑膜細(xì)胞中增加Toll樣受體的表達(dá)[19];研究發(fā)現(xiàn)，p53具有控制炎癥反應(yīng)的新功能，因此，干擾p53通路是治療RA的有效策略[20];FOXO基因的轉(zhuǎn)錄失調(diào)可能與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21];JAK-STAT信號通路[22]、PI3K-Akt信號通路[23]、NF-κB信號通路[24]等與RA這種炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制亦密切相關(guān)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對川烏、白芍活性成分、作用靶點(diǎn)、作用通路進(jìn)一步探討，發(fā)現(xiàn)川烏、白芍中的芍藥苷、β-谷甾醇、山柰酚、兒茶素等成分可能通過IL-6、Akt1、CASP3、PTGS2等靶點(diǎn)作用于AGE-RAGE、IL-17、TNF、p53、FOXO、JAK-STAT、PI3K-Akt、NF-κB等信號通路發(fā)揮治療RA的作用，川烏、白芍多靶點(diǎn)、多通路治療RA的機(jī)制得到初步驗證，可為下一步研究提供參考;但川烏-白芍藥對治療RA復(fù)雜的機(jī)制，還有待進(jìn)一步試驗驗證。

參考文獻(xiàn)

[1] FALCONER J，MURPHY AN，YOUNG SP，et al.Review：synovial cell metabolism and chronic inflammation in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheumatol，2018，70（7）：984-999.

[2] PAN X，LOPEZ-OLIVO MA，SONG J，et al.Systematic review of the methodological quality of controlled trials evaluating Chinese herbal medicine in patients with rheumatoid arthritis[J].BMJ Open，2017，7（3）：e013242.

[3] 劉丹凱，王強(qiáng)，魏賑權(quán)，等.昆明山海棠-雞血藤藥對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國藥房，2019，30（19）：2639-2644.

[4] 阮文憲，何娟，湯小虎.中藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎用藥特點(diǎn)初探[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2019，8（3）：22-27.

[5] 鄭春松，黃綏心，葉蕻芝，等.從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度研究白芍治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2017，6（5）：11-15，34.

[6] 吳平.川烏提取物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的體外藥效學(xué)研究[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2018.

[7] 李晉奇，彭成，姬潔瑩.制川烏總堿與白芍總苷、白芍多糖配伍治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的作用機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2009，34（22）：2937-2942.

[8] GUO Q，WANG Y，XU D，et al.Rheumatoid arthritis：pathological mechanisms and modern pharmacologic therapies[J]Bone Res，2018，6（1）：15.

[9] 馬瀟苒，李無陰.中藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2018，7（10）：66-70.

[10] HU W，F(xiàn)U W，WEI X，et al.A network pharmacology study on the active ingredients and potential targets of Tripterygium wilfordii hook for treatment of rheumatoid arthritis[J].Evid Based Complement Alternat Med，2019（1）：5276865.

[11] 任爽，倪力強(qiáng)，孟迪，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃柏-透骨草治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制[J].中國新藥與臨床雜志，2019，38（12）：757-766.

[12] LI B，XIAO Y，XING D，et al.Circulating interleukin-6 and rheumatoid arthritis：a Mendelian randomization meta-analysis[J].Medicine，2016，95（23）：e3855.

[13] YANG S，XING Z，LIU T，et al.Synovial tissue quantitative proteomics analysis reveals paeoniflorin decreases LIFR and ASPN proteins in experimental rheumatoid arthritis[J].Drug Des Develo Ther，2018，12（1）：463-473.

[14] LIU R，HAO D，XU W，et al.β-Sitosterol modulates macrophage polarization and attenuates rheumatoid inflammation in mice[J].Pharm Biol，2019，57（1）：161-168.

[15] LEE CJ，MOON SJ，JEONG JH，et al.Kaempferol targeting on the fibroblast growth factor receptor 3-ribosomal S6 kinase 2 signaling axis prevents the development of rheumatoid arthritis[J].Cell Death Dis，2018，9（3）：401.

[16] FECHTNER S，SINGH A，CHOURASIA M，et al.Molecular insights into the differences in anti-inflammatory activities of green tea catechins on IL-1β signaling in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol，2017，329（1）：112-120.

[17] ASADIPOOYA K，UY EM.Advanced glycation end products（AGEs），receptor for AGEs，diabetes，and bone：review of the literature[J].J Endocr Soc，2019，3（10）：1799-1818.

[18] VARAS A，VALENCIA J，LAVOCAT F，et al.Blockade of bone morphogenetic protein signaling potentiates the pro-inflammatory phenotype induced by interleukin-17 and tumor necrosis factor-α combination in rheumatoid synoviocytes[J].Arthritis Res Ther，2015，17（1）：192.

[19] LEE SY，YOON BY，KIM JI，et al.Interleukin-17 increases the expression of Toll-like receptor 3 via the STAT3 pathway in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J].Immunology，2014，141（3）：353-361.

[20] ZHANG T，LI H，SHI J，et al.p53 predominantly regulates IL-6 production and suppresses synovial inflammation in fibroblast-like synoviocytes and adjuvant-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther，2016，18（1）：271.

[21] 郭錦晨，劉健，王鍵，等.基于AMPK-FoxO3a-MnSOD信號通路探討類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者氧化應(yīng)激的機(jī)制及黃芩清熱除痹膠囊對其影響[J].免疫學(xué)雜志，2019，35（8）：681-690.

[22] BANERJEE S，BIEHL A，GADINA M，et al.JAK-STAT signaling as a target for inflammatory and autoimmune diseases：current and future prospects[J].Drugs，2017，77（5）：521-546.

[23] HUANG Z，XING S，LIU M，et al.MiR-26a-5p enhances cells proliferation，invasion，and apoptosis resistance of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis by regulating PTEN/PI3K/Akt pathway[J].Biosci Rep，2019，39（7）：20182192.

[24] SUN SC.The non-canonical NF-κB pathway in immunity and inflammation[J].Nat Rev Immunol，2017，17（9）：545-558.

收稿日期：2020-10-18;修回日期：2020-11-25