禽白血病病毒衣殼蛋白p15基因慢病毒表達載體的構建及其在雞肝癌細胞系中的表達

沈逵，何倩，秦愛建,3，錢琨,3*

(1.揚州大學教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009)

禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)是一種能夠引起宿主產(chǎn)生嚴重免疫抑制的反轉錄病毒，最終導致宿主產(chǎn)生多種惡性腫瘤[1]。嚴重的免疫抑制常常造成多種病原的混合感染，有研究表明，先天感染ALV是導致雞馬立克病疫苗免疫效果低下的主要原因之一[2]，其與禽網(wǎng)狀內皮組織增生癥病毒共感染條件下可以促進彼此的復制[3-4]，因此ALV對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴重。

ALV的基因組具有典型的慢轉化型反轉錄序列：5′-R-U5-gag-pol-env-U3-R-3′[5]，主要編碼各種結構蛋白(gag、pol、env)，包括磷蛋白(如p19)、核衣殼蛋白(如p15、p27)、DNA聚合/整合酶蛋白(如p68、p32)、囊膜蛋白(如gp85、gp37)等。gag基因十分保守，主要編碼12 kDa、15 kDa、19 kDa和27 kDa 4種蛋白質，它們分別命名為p12、p15、p19和p27，其中p15和p27為衣殼蛋白[6]。目前對病毒編碼蛋白的研究主要集中在p27、gp85和gp37蛋白，已報道的研究發(fā)現(xiàn)，gp37在胞漿區(qū)域的C末端酪氨酸基序在體內外均可影響ALV-J的致病性[7]，gp85含有病毒受體決定簇，其高變區(qū)和可變區(qū)決定了ALV的中和活性和特異性[8]，p27存在多種抗原表位，基因組十分保守，是群特異性抗原，常被作為各亞群ALV的檢測指標[9]。衣殼蛋白p15作為一種由124個氨基酸組成的蛋白酶，可對gag和pol基因編碼的多聚蛋白進行切割，使其加工成為成熟的非糖基化蛋白和一些多肽。有研究表明，gag末端攜帶活化狀態(tài)下的p15時，前體蛋白的成熟和釋放過程將十分迅速，并且p15-蛋白N端的7個氨基酸組成的區(qū)域有增加病毒裝配效率的作用[10]。但目前對于衣殼蛋白p15的生物學功能研究還知之甚少。

慢病毒載體作為一種十分靈活且強大的載體工具，可實現(xiàn)持續(xù)的基因傳遞、穩(wěn)定地將載體整合到宿主基因組，在分裂和非分裂細胞中均可表達，其感染效率可達到80%以上[11]。近年來，慢病毒載體廣泛應用于生物醫(yī)學領域，在畜牧獸醫(yī)領域也有大量報道。Kang等[12]構建了含有山羊chi-pri-mir-204基因的重組慢病毒載體pCDH-CMV-mir204-EF1-GreenPuro，包裝產(chǎn)生的慢病毒可影響小鼠生精小管中Sirt1、Oct4和Plzf等相關基因的表達；龐中兵等[13]成功以慢病毒表達載體共表達Cas9和sgRNA，獲得了一株敲除TLR4基因的DF-1細胞系。本研究嘗試構建了禽白血病病毒p15基因的慢病毒表達載體，并檢測p15蛋白在LMH細胞中的表達，為在禽源細胞中深入研究p15蛋白的生物學功能提供良好的生物材料。

1 材料與方法

1.1 細胞與質粒

人腎上皮細胞系(HEK 293T)、雞肝癌細胞系(LMH)均由本實驗室保存。真核表達的質粒pCAGGS-p15由實驗室構建、鑒定、保存。慢病毒骨架質粒pLVX-IRES-ZsGreen1，輔助質粒慢病毒外殼蛋白表達質粒psPAX2(pHelper1)和慢病毒膜蛋白表達質粒pMD2·G(pHelper2)均由西北農(nóng)林科技大學趙欽教授饋贈。DH5ɑ感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

胎牛血清，DMEM-F12(1∶1)培養(yǎng)基，Opti-MEM培養(yǎng)基均購自GIBCO公司；雙抗購自碧云天公司；T4連接酶購自Promega公司；RIPA細胞裂解液購于Cell Signaling Technology公司；兔源抗Flag多克隆抗體購自Proteintech公司；1 kb DNA Maker、預染蛋白質Marker購自康為世紀公司；ECL化學發(fā)光顯色液購自Bio-Rad公司；山羊抗兔IgG Alexa 594購于Jackson公司；Hoechst 33342細胞核染色試劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠、抗兔IgG全分子抗體、聚凝胺(polybrene)均購自SIGMA公司；BCA蛋白定量試劑盒、高保真PCR反應試劑盒購自南京諾唯贊公司；限制性核酸內切酶XhoⅠ(FD)、EcoRⅠ(FD)、熒光定量反轉錄試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ 購于寶生物工程(大連)有限公司；轉染試劑TransIT-X2購自Mirus公司，其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)NCBI查到的ALV-J基因序列(GenBank No.Z46390.1)中p15片段序列設計引物序列，引物下游3′端融合有Flag標簽。利用DNAStar設計PCR引物序列如下(下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，斜體為Flag標簽序列，擴增片段的長度為372 bp)：

p15-F：CGGAATTCATGTTAGCGATGACAATGGAACATAA;

p15-R：GCCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTAAATTTGTCAAGCGGAGCCCT。

1.4 慢病毒質粒的構建

以本實驗室前期制備的真核表達質粒pCAGGS-p15為模板擴增目的片段。p15基因PCR擴增體系為：2×Phanta Max Buffer 25 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，p15-F(10 μmol/L) 2 μL，p15-R(10 μmol/L) 2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，質粒pCAGGS-p15 2.4 μL，ddH2O 16.6 μL，共50 μL體系。反應程序為：95 ℃預變性3 min；之后95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，降至4 ℃。反應產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定，條帶大小正確后切膠回收，用于酶切。

酶切反應均使用快切酶，分別酶切膠后，回收產(chǎn)物和慢病毒骨架質粒。反應體系為：10×Green Buffer 2 μL，EcoRⅠ(FD)1 μL，XhoⅠ(FD)1 μL，膠回收片段產(chǎn)物3 μL，ddH2O 13 μL，共20 μL體系。置于37 ℃水浴鍋中反應15 min，將產(chǎn)物進行純化并回收。骨架質粒plvx-IRES-ZsGreen1使用相同處理方法以獲得黏性末端用于連接。

連接體系為：2×T4 DNA Ligase Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，酶切骨架質粒plvx-IRES-ZsGreen 11 μL，酶切目的片段回收產(chǎn)物 3 μL，共20 μL體系。4 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉化至DH5ɑ感受態(tài)細胞中，次日挑取單個菌落，抽提質粒，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行DNA測序。測序正確的質粒用于后續(xù)試驗，并命名為plvx-p15-Flag。

1.5 慢病毒的包裝和滴度測定

1.5.1 慢病毒的包裝和收集

將3×107個HEK 293T細胞接種于T25規(guī)格細胞方瓶中，培養(yǎng)12 h，待密度達到約80%時進行細胞轉染。

轉染體系質?？偭繛? μg，質粒含量比例為：plvx-p15-Flag(慢病毒骨架質粒)∶psPAX2(慢病毒外殼表達質粒)∶pMD2·G(慢病毒膜蛋白表達質粒) = 5∶4∶1。轉染體系為：3 μg plvx-p15-Flag+2.4 μg psPAX2+0.6 μg pMD2·G+18 μL TransIT-X2，轉染過程按照TransIT-X2說明書進行。

于顯微鏡下觀察共轉染細胞，每隔12 h觀察1次。待視野下自發(fā)熒光細胞數(shù)目達到50%以上時，凍融細胞，離心收取上清，置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 慢病毒滴度測定

取HEK 293T細胞接種入12孔板中，每孔約9×105個細胞，培養(yǎng)過夜；次日，用梯度稀釋法稀釋pLvx-p15-Flag病毒液，以相應稀釋倍數(shù)(100，10-1，10-3)稀釋病毒液，每孔加入300 μL，感染293T細胞72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，并計數(shù)綠色熒光細胞數(shù)，計算慢病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)=綠色熒光細胞數(shù)量×病毒液稀釋倍數(shù)/病毒液體積。

1.6 plvx-p15-Flag質粒的慢病毒感染及目的蛋白表達的鑒定

將293T細胞、LMH細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約120萬個細胞，待細胞生長至80%～90%密度時，可用于感染。將凍存于-70 ℃的病毒上清液于室溫融解，按照1 000∶1的比例與polybrene混合感染293T細胞和LMH細胞。每隔24 h于顯微鏡下觀察。

1.6.1 激光共聚焦檢測p15蛋白表達

LMH細胞接種于細胞飛片上，達到90%密度用于慢病毒感染，感染后培養(yǎng)至綠色熒光細胞數(shù)目達30%～40%。取出細胞飛片用4%多聚甲醛固定細胞10 min，0.25%的Triton X-100破膜作用約5 min，再使用1% BSA(含有1%～2%的山羊血清)于37 ℃下封閉30 min，PBS洗3遍。一抗使用兔源抗Flag多克隆抗體(1∶100稀釋)37 ℃下作用45 min，二抗使用山羊抗兔IgG Alexa 594熒光二抗(1∶1 000稀釋)37 ℃孵育35 min，染核使用1 μg /mL的Hoechst 33342，室溫下作用5～8 min，用適量50%甘油封片，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 Western blot檢測p15蛋白的表達

向感染細胞中加入RIPA細胞裂解液(含1 mmol/L 蛋白酶抑制劑)，置于冰上裂解，每10 min渦旋1次，共30 min，裂解后13 000 r/min離心15 min 收取細胞蛋白，經(jīng)BCA定量后，進行SDS-PAGE蛋白分析。轉膜完成后進入Western blot反應，一抗使用1 ∶2 000稀釋的兔源抗Flag多克隆抗體，二抗使用1∶30 000稀釋的HRP(辣根過氧化物酶)標記山羊抗兔IgG。最終使用ECL顯色液進行顯色分析。

1.6.3 實時熒光定量PCR檢測病毒感染細胞中p15基因表達情況

將慢病毒感染293T、LMH細胞，待感染出現(xiàn)特異性熒光時，采用Axygen試劑盒提取細胞總RNA，按照Takara反轉錄試劑盒說明進行反轉錄，每個樣品的反應體系為10 μL，5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，模板RNA 1 μg，42 ℃ 2 min；之后再每管加入PrimerScript RT Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5× PrimerScript Buffer2緩沖液4 μL，RNase free dH2O 4 μL，總體系20 μL，混勻后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-20 ℃保存。以反轉錄cDNA作為模板，利用qRT-PCR檢測細胞中p15表達水平，相關引物序列見表1。反應體系如下：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer和Reverse Primer(10 μmol/L)各0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ 0.4 μL，添加RNase free dH2O至總體積20 μL；反應程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；最后階段為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣本獨立做3個重復孔。

表1 qRT-PCR檢測引物序列

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

每個試驗樣本做3次獨立重復，所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計，分析不同試驗樣本的顯著性差異變化。

2 結果

2.1 慢病毒表達質粒的構建與鑒定

利用設計的引物進行p15基因的PCR擴增，反應產(chǎn)物進行核酸電泳鑒定，在372 bp處可見目的條帶(圖1A)。p15雙酶切后連接于載體質粒，將連接產(chǎn)物轉化至DH5ɑ感受態(tài)細胞中，從單菌落培養(yǎng)物中抽提質粒，雙酶切后用于核酸電泳鑒定，條帶大小正確(圖1B)。

2.2 慢病毒滴度測定結果

接種293T細胞于12孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)約為9×105個，不同稀釋倍數(shù)下病毒液感染細胞，通過熒光細胞計數(shù)，在10-3稀釋度下綠色熒光細胞數(shù)目約為25%。計算可得慢病毒的病毒液滴度值約為9×105×25%×10-3/0.001=2.25×105TU/mL。試驗結果表明，產(chǎn)生的慢病毒具有高效的細胞感染能力。

A.p15基因PCR產(chǎn)物；B.雙酶切核酸電泳鑒定；1.Marker；2.p15基因的PCR產(chǎn)物；3.雙酶切后pLVX-IRES-ZsGreen1空載體；4.雙酶切含p15基因的骨架質粒plvx-p15-Flag圖1 p15基因的PCR擴增及慢病毒骨架質粒的雙酶切鑒定

A、B、C.慢病毒稀釋倍數(shù)依次為1、101、103圖2 不同稀釋度的plvx-p15-Flag慢病毒感染293T細胞后GFP熒光表達(200×)

2.3 293T細胞中p15蛋白表達情況

慢病毒液感染細胞后，可以觀察到特異性熒光，隨著感染時間延長，孔內特異性細胞數(shù)目逐漸增多(圖3A)。收集感染0 h，48 h，72 h，96 h的293T細胞RNA進行qRT-PCR檢測p15基因的表達情況。結果顯示，p15基因表達隨著感染時間延長而不斷升高(圖3B)；同時收集不同時間點的細胞蛋白進行免疫印跡，結果顯示，病毒感染48 h、72 h和96 h均可檢測出p15蛋白的表達(圖3C)。

2.4 病毒感染LMH細胞中p15表達水平檢測

接種LMH細胞于12孔細胞板，培養(yǎng)過夜。次日，按照1.6所述方法感染細胞，每24 h觀察一次特異性熒光，并收集細胞RNA，用于qRT-PCR檢測p15基因表達水平，檢測結果顯示隨著感染時間延長，p15表達量顯著上升(圖4A)?？梢娐《靖腥厩菰碙MH細胞可以高效表達外源基因。待感染組細胞自發(fā)熒光數(shù)目達到40%以上時，加入RIPA細胞裂解液，收集蛋白用于Western blot驗證，結果顯示病毒感染LMH細胞72和96 h可以檢測出p15蛋白目的條帶(圖4B)，病毒感染后96 h的共聚焦熒光觀察結果也證實p15蛋白主要在病毒感染胞漿中表達(圖4C)。

A.不同感染時間點特異性熒光細胞數(shù)目觀察；B.qRT-PCR檢測不同感染時間點p15基因表達情況；C.蛋白免疫印跡檢測病毒感染后p15蛋白表達水平;*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001。下同圖3 plvx-p15-Flag感染293T細胞中的基因和蛋白的表達

A.qRT-PCR檢測慢病毒感染LMH細胞后不同感染時間點p15基因表達(*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001)；B.蛋白免疫印跡檢測p15的蛋白表達情況；C.慢病毒感染LMH細胞中p15蛋白表達及定位(紅色熒光為Flag蛋白，綠色熒光為ZsGreen蛋白，雙色熒光重合細胞為感染成功的LMH細胞)圖4 plvx-p15-Flag感染LMH細胞中目的基因和蛋白的表達

3 討論

在ALV的多個亞群中，不同亞群致病力有顯著性差異[14]，其中J亞群既可水平傳播又可垂直傳播，致病力最強，對肉雞和蛋雞危害嚴重[15-16]，主要體現(xiàn)在致腫瘤和免疫抑制兩個方面，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。近年來，國內外科學家對于禽白血病致病機理開展了大量研究工作，但對于病毒的致病機制仍知之甚少。

ALV-J基因組的編碼區(qū)形成3個大的開放閱讀框[17]，其gag片段編碼的衣殼蛋白p27是主要的群特異性抗原，現(xiàn)在已經(jīng)作為疾病檢測抗原被廣泛認可[18]。對同為衣殼蛋白的p15蛋白酶的研究鮮有報道，通過比對A、B、E、J、K等多個亞群不同來源毒株的p15基因序列，發(fā)現(xiàn)其同源性在95%以上，其發(fā)揮怎樣的生物學功能還未知。HIV作為典型的反轉錄病毒，其結構蛋白中也有類似p15蛋白酶的p6蛋白酶，僅有52個氨基酸，且Schmalen等[19]研究表明，HIV-1 p6對胰島素降解酶(IDE)介導的降解的敏感性與p6的N端氨基酸有關，可通過N端的脯氨酸殘基來阻止HIV-1 p6蛋白被IDE降解，p6穩(wěn)定表達后可明顯發(fā)現(xiàn)HIV-1復制能力降低且依賴于Env[20]，而且其N端氨基酸的突變很大程度上決定了HIV在人和猩猩之間的傳播[21]。從HIV-1 p6蛋白酶研究中獲得啟示，成熟的ALV-J p15蛋白在病毒復制、疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用與功能，但目前關于p15的研究工具十分匱乏，故本研究利用慢病毒載體可以高效表達外源基因的特點，首次構建ALV-J p15基因的慢病毒表達載體，并按照比例包裝成為慢病毒感染系統(tǒng)，共聚焦免疫熒光、qRT-PCR和Western blot檢測結果均證實，該系統(tǒng)可有效地介導p15基因在LMH細胞內表達。經(jīng)蛋白定位的共聚焦熒光觀察可明顯發(fā)現(xiàn)p15蛋白主要在胞漿中表達，使用qRT-PCR可在48 h檢測到LMH細胞中表達的p15基因，但在48 h的Western blot檢測結果中卻未見p15蛋白條帶，這可能是由于人源啟動子在禽源細胞中識別、表達緩慢造成的。下一步研究中，計劃構建一株可穩(wěn)定表達p15蛋白的LMH細胞系，在這種細胞模型基礎上，研究p15蛋白的生物學功能，將十分便捷和高效。

綜上所述，本試驗成功構建了表達p15基因的慢病毒表達載體，這一工具將有助于揭示p15蛋白在ALV感染復制、免疫抑制以及相關免疫學信號通路中發(fā)揮的重要作用及其機制。