基因2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的遺傳變異與演化

張振東，曲向陽(yáng)，徐孝宙，邢軍*

(1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.南京博維特健康管理有限公司，江蘇 南京 211800；3.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種以母豬的繁殖障礙、生長(zhǎng)豬的呼吸道疾病以及感染豬的繼發(fā)感染為主要癥狀的重要疫病。從全球范圍看，除澳大利亞、新西蘭、瑞士、挪威、芬蘭和瑞典等國(guó)家無(wú)PRRS疫情外，其他養(yǎng)豬生產(chǎn)國(guó)家均無(wú)一幸免。PRRS在我國(guó)習(xí)慣被稱(chēng)為“豬藍(lán)耳病”，疫情更為復(fù)雜。

PRRSV是一種呈球形、有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子大小為60～65 nm，全長(zhǎng)基因組約15 kb。2016年，國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)將PRRSV、小鼠乳酸脫氫酶病毒(mouse lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)和大鼠動(dòng)脈炎病毒1(rat arterivirus 1)歸為套式病毒目(Nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)豬動(dòng)脈炎病毒屬(Porartevirus)，基因1型和2型PRRSV也被重新定為2個(gè)種，分別稱(chēng)為PRRSV1和PRRSV2[1]，我國(guó)主要以PRRSV2的流行為主。PRRSV極易變異與重組，宿主的天然免疫和特異性免疫因素，以及其他篩選壓力加速了病毒核苷酸的突變，而當(dāng)兩株或多株病毒同時(shí)感染同一宿主時(shí)又可發(fā)生高頻率的重組。此外，PRRSV異源毒株間交叉保護(hù)性差，變異毒株、演化毒株及重組毒株等新毒株的出現(xiàn)往往導(dǎo)致新疫情的流行。因此，自20世紀(jì)80年代出現(xiàn)以來(lái)，PRRSV的分子流行病學(xué)和遺傳變異問(wèn)題一直是關(guān)注的熱點(diǎn)，本文就PRRSV 2毒株在遺傳演化方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為PRRS的免疫防控提供參考依據(jù)。

1 PRRSV2的遺傳演化與多樣性

1.1 PRRSV2自然流行毒株的變異與演化

PRRSV2于1987年在北美北卡羅來(lái)納州首先暴發(fā)后，隨即迅速在北美洲地區(qū)廣泛流行并傳播至其他國(guó)家和地區(qū)。1992年，Benfield等[2]從組織病料中首次分離到原型毒株VR-2332。隨后在亞洲一些國(guó)家或地區(qū)也相繼暴發(fā)PRRS疫情并分離到PRRSV毒株，且多與北美地區(qū)的分離株高度同源，這說(shuō)明疫情的暴發(fā)極有可能與從疫區(qū)引進(jìn)種豬或其他相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易有關(guān)[3]。PRRSV暴發(fā)后在各個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行著獨(dú)立的變異和演化，大量的PRRSV序列和毒株被檢測(cè)以及分離。Shi等[4]基于8 624個(gè)ORF5基因序列進(jìn)行了PRRSV2的遺傳演化分析，該結(jié)果得到了大家的認(rèn)可并被廣泛引用。在該分析中PRRSV2被劃分為9個(gè)譜系(lineage)，相鄰譜系間的遺傳演化距離至少為10%以上，超過(guò)85%的序列分布于4個(gè)大的譜系，即：譜系1、5、8和9，剩余毒株分布于5個(gè)小的譜系，譜系內(nèi)又根據(jù)演化距離7%為閾值劃分為不同的sub-lineage，比如譜系8和9分別包括9個(gè)和17個(gè)sub-lineages。PRRSV2原型毒株VR-2332、中國(guó)BJ-4、韓國(guó)PL97-1以及丹麥等國(guó)家早期分離株屬于譜系5[3,5]，該譜系毒株最具“國(guó)際范”，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，這可能與疫苗毒Resp/PRRS MLV在全球范圍內(nèi)的廣泛使用有關(guān)。加拿大的早期分離毒株IAF-EXP91屬于譜系1[4,6]，該譜系在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中位于根的位置且其中的毒株大部分來(lái)自加拿大的魁北克，而目前記錄的最早的PRRSV陽(yáng)性血清發(fā)現(xiàn)地也是位于加拿大，因此普遍認(rèn)為PRRSV2起源于加拿大。1996年，泰國(guó)學(xué)者第一次在其國(guó)內(nèi)分離到PRRSV2毒株，其與IAF-EXP91同源關(guān)系最近，屬于譜系1。美國(guó)明尼蘇達(dá)州出現(xiàn)以nsp2存在131個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失為特征的變異株MN184[8]，進(jìn)化樹(shù)分析其屬于譜系1，推測(cè)其是加拿大譜系1傳入后的變異演化株。Brockmeier等[9]報(bào)道了演化于MN184的高毒力毒株NADC30，該毒株分離于2008年并于2013年開(kāi)始傳入中國(guó)[10]，造成了我國(guó)PRRS新疫情的發(fā)生和再度流行。最新研究發(fā)現(xiàn)，NADC30-like毒株已經(jīng)在韓國(guó)出現(xiàn)并流行[11]。1996年夏天，美國(guó)暴發(fā)嚴(yán)重型PRRS[12]，分離毒株屬于譜系8和9，而中國(guó)1996年首次分離到的PRRSV毒株CH-1a同樣屬于譜系8，這是否與美國(guó)暴發(fā)的嚴(yán)重型PRRS有關(guān)值得探討。隨后，在一段相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，中國(guó)PRRSV分離株以譜系8為主，包括2006暴發(fā)的以nsp2高變區(qū)30個(gè)氨基酸缺失為特征的HP-PRRSV，HP-PRRSV流行于東南亞地區(qū)的[13]。譜系9毒株主要流行于美國(guó)、日本、墨西哥和意大利等地區(qū)，包含了當(dāng)時(shí)數(shù)據(jù)庫(kù)中大部分的PRRSV序列(2 800/8 624)。臺(tái)灣分離株MD-001、中國(guó)分離株FJ-1以及香港地區(qū)擴(kuò)增到的部分PRRSV序列屬于譜系3。2005年之后基本上未分離到該譜系毒株，但近年來(lái)中國(guó)東南部地區(qū)重新出現(xiàn)譜系3毒株，并具有小范圍流行趨勢(shì)[14]。譜系2、4、6和7內(nèi)的毒株數(shù)量少，曾在不同的地區(qū)散發(fā)流行，近年來(lái)未見(jiàn)有關(guān)這幾個(gè)譜系內(nèi)毒株的文獻(xiàn)報(bào)道。2013年美國(guó)出現(xiàn)ORF5 RFLP 1-7-4(NADC34)分支的PRRSV毒株并正在多個(gè)地區(qū)流行[15]，其以nsp2編碼區(qū)100個(gè)氨基酸的連續(xù)缺失為特征，2017年下半年，我國(guó)分離到NADC34-like毒株[16]。

1.2 PRRSV2疫苗毒株及重組毒株的變異與演化

常用的PRRSV2減毒活疫苗(MLV)有“Resp/PRRS”(親本毒株為VR-2332，譜系5)、“ATP”(親本毒株為JA142，譜系8)、“CH-1R”(親本毒株為CH-1a，譜系8)、“R98”(親本毒株為R98，譜系5)、“HP-PRRSV MLV”(親本毒株為HP-PRRSV，譜系8)以及于2000年退出市場(chǎng)的“PrimePac”(親本毒株為Neb-1，譜系7)。在丹麥?zhǔn)褂眠^(guò)Resp/PRRS減毒活疫苗的豬場(chǎng)暴發(fā)PRRS疫情，從弱仔和死亡豬只中分離到的毒株與疫苗毒高度同源，這也是歐洲地區(qū)的第一個(gè)PRRSV2案例[17]；同時(shí)，從丹麥地區(qū)未免疫過(guò)PRRSV疫苗的豬場(chǎng)分離到毒株DK-1997-19407B，該毒株與疫苗毒Resp/PRRS的全基因組核苷酸同源性高達(dá)99.4%[18]，而Kvisgaard等[19]對(duì)丹麥地區(qū)15年內(nèi)分離到的PRRSV2毒株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)與疫苗毒有關(guān)，這說(shuō)明PRRSV疫苗毒不僅可以返強(qiáng)，而且會(huì)在一個(gè)地區(qū)內(nèi)廣泛的傳播和流行。另外，意大利、澳大利亞、波蘭以及匈牙利等多個(gè)國(guó)家也分離到PRRSV2的疫苗演化毒株[17,20-21]。1998年美國(guó)愛(ài)荷華州一未免疫豬場(chǎng)暴發(fā)PRRS疫情，經(jīng)研究分析證實(shí)，該疫情是由Resp/PRRS疫苗返強(qiáng)毒株98-37120-2引起[22]。在我國(guó)，從未使用過(guò)HP-PRRSV弱毒苗的豬場(chǎng)分離到3株JXA1-P80的返強(qiáng)毒株NT1、NT2和NT3[23]，Yu等[24]2014年分離株JX2014T2全基因組核苷酸同源性與TJ野毒株高度同源，且其nsp2區(qū)域存在TJM-F92特有的120個(gè)氨基酸缺失，說(shuō)明JX2014T2為T(mén)JM-F92的返強(qiáng)毒株，而Zhang等[25]從一個(gè)豬場(chǎng)也分離到了兩種疫苗毒HuN4-F112和TJM-F92的演化毒株HeN1201與HeN1301。

1996年，Kapur等[26]在對(duì)田間10個(gè)分離株橫跨ORF2-7的片段進(jìn)行分析時(shí)，第一次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了PRRSV2田間毒株的重組現(xiàn)象。Yuan等[27]在細(xì)胞水平上證實(shí)了PRRSV2可發(fā)生較高頻率的重組而產(chǎn)生新的病毒。隨后，來(lái)自美國(guó)、墨西哥以及中國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的專(zhuān)家學(xué)者檢測(cè)到了PRRSV2重組現(xiàn)象的發(fā)生[28-30]，但絕大多數(shù)都是基于ORF5序列的分析，真正分離到的重組病毒并不多見(jiàn)，這可能與親本病毒更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)有關(guān)[27]。Li等[31]從發(fā)病仔豬身上分離到了疫苗毒株CH-1R和高致病性毒株WUH1的重組毒株Em2007，這是PRRSV2疫苗毒株與田間毒株發(fā)生重組的首次報(bào)道。Shi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，2009至2010年中國(guó)高致病毒株的再次流行就是源于HP-PRRSV與經(jīng)典毒株的重組。對(duì)全球范圍內(nèi)PRRSV毒株的系統(tǒng)分析，也進(jìn)一步證實(shí)了重組是發(fā)生于PRRSV毒株間的一個(gè)普遍現(xiàn)象。將同屬于PRRSV2譜系8的兩個(gè)毒株JXwn06-81c和HB-1/3.9c共感染豬，結(jié)果表明兩毒株在豬體內(nèi)可發(fā)生重組，且重組模式多樣和復(fù)雜[32]。早期報(bào)道的重組基本上是發(fā)生于同譜系內(nèi)的毒株或者說(shuō)具有高度同源性的兩個(gè)親本毒株之間，鮮有報(bào)道不同譜系毒株或者說(shuō)同源性偏低毒株的重組現(xiàn)象。Lu等[33]分析發(fā)現(xiàn)，GM2是由野外新流行毒株QYYZ(譜系3)與疫苗毒株Resp/PRRS(譜系5)的重組病毒。NADC30毒株(譜系1)2013年傳入中國(guó)，其表現(xiàn)出了與我國(guó)毒株極易重組的特性，尤其是與疫苗毒或疫苗演化毒(譜系8的HP-PRRSV MLV，譜系5的Resp/PRRS MLV)，這可能與PRRSV減毒活疫苗在我國(guó)的廣泛使用有關(guān)。大量的重組毒株被分離報(bào)道，甚至出現(xiàn)了三四個(gè)譜系等多譜系毒株重組的現(xiàn)象，重組模式亦越發(fā)復(fù)雜[10,34]。

2 我國(guó)PRRSV的遺傳演化與多樣性

PRRS最早在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)暴發(fā)，1991、1992年先后分離到毒株MD001和WSV。WSV與PRRSV2原型毒株VR-2332高度同源，屬于譜系5；而MD001進(jìn)化樹(shù)上形成獨(dú)立的分支，屬于譜系3?；贛D001和WSV兩個(gè)原型毒株，臺(tái)灣地區(qū)PRRSV主要分布于兩個(gè)群體且以MD001群體為主[35]。在大陸地區(qū)，我國(guó)動(dòng)檢部門(mén)在1995年從加拿大引進(jìn)的種豬中檢測(cè)到了PRRSV抗體陽(yáng)性豬[3]，郭寶清等[36]率先從發(fā)病豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒樣本中分離到毒株CH-1a，隨后，楊漢春等[5]分離到BJ-4。雖然CH-1a最早被分離，但其全基因組序列與VR-2332差異較大，該毒株是否發(fā)源于我國(guó)、或是由其他國(guó)家和地區(qū)傳入尚無(wú)定論，但學(xué)者普遍將其歸為我國(guó)的本土毒株。BJ-4與VR-2332高度同源，屬于譜系5，進(jìn)化樹(shù)上其與VR-2332的疫苗毒株RespPRRS親緣關(guān)系更近，推測(cè)該毒株是由引進(jìn)疫苗免疫種豬、私自使用減毒活疫苗或者其他相關(guān)產(chǎn)品的貿(mào)易活動(dòng)而傳入我國(guó)。自上世紀(jì)90年代出現(xiàn)以來(lái)，PRRSV在2～3年內(nèi)便迅速傳播至我國(guó)各個(gè)地區(qū)，并在復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行著變異與演化[37]。Gao等[38]從河北地區(qū)分離到兩株CH-1a的演化毒株HB-1(sh)/2002和HB-2(sh)/2002，其中HB-2(sh)/2002的nsp2和GP3區(qū)域分別存在12個(gè)和1個(gè)氨基酸的缺失，這是我國(guó)首次分離到的基因組天然缺失毒株。2004年分離毒株NB/04的nsp2編碼區(qū)存在1個(gè)氨基酸的缺失(第481位)。2006年，我國(guó)豬群出現(xiàn)以高熱、高發(fā)病率和高死亡率以及妊娠母豬嚴(yán)重的繁殖障礙為特征的HP-PRRSV，其nsp2編碼區(qū)存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失(第481位，531-561位)[39]，雖然Zhou等[40]已經(jīng)證實(shí)該缺失與其致病力無(wú)關(guān)，但該特征作為HP-PRRSV的分子標(biāo)志常被用來(lái)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。此后數(shù)年內(nèi)，HP-PRRSV及其演化毒株成為了我國(guó)田間的主要優(yōu)勢(shì)流行毒株。

據(jù)Han等[41]研究報(bào)道，自2006年HP-PRRSV暴發(fā)以來(lái)，我國(guó)的PRRS疫情可分為3個(gè)流行階段。2006至2008年以最初暴發(fā)的具有高同源性的HP-PRRSV為主，2007年到達(dá)流行的高峰。Li等[42]人的研究進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果，其發(fā)現(xiàn)2007年629分樣品中HP-PRRSV的檢出率高達(dá)64.86%，而未檢測(cè)到經(jīng)典毒株。第二階段為2009至2012年，PRRSV毒株之間的重組活動(dòng)導(dǎo)致了疫情的再度流行[28]，并且自該時(shí)期開(kāi)始PRRSV變異與演化的速率呈現(xiàn)出明顯加快的趨勢(shì)，特別是nsp2編碼區(qū)不同缺失、插入及突變類(lèi)型的新毒株和重組毒株的出現(xiàn)，可能與HP-PRRSV減毒活疫苗的逐步推廣使用有關(guān)。2013年以來(lái)為第三階段，近年來(lái)HP-PRRSV似乎已經(jīng)“銷(xiāo)聲匿跡”，生產(chǎn)中由其引起的疫情已不多見(jiàn)，取而代之的是散發(fā)的病例和一些亞臨床感染，分離到的毒株多數(shù)是HP-PRRSV疫苗毒、疫苗演化毒株及其與NADC30-like毒株的重組毒株[25,34]。2017年下半年，我國(guó)分離到nsp2編碼區(qū)100個(gè)氨基酸的連續(xù)缺失為特征NADC34-like毒株[17]，其是否會(huì)造成新的流行，需要我們的不斷監(jiān)測(cè)和持續(xù)跟蹤。以QYYZ為代表的PRRSV2譜系3毒株自2010年開(kāi)始在我國(guó)東南部地區(qū)重新流行并有擴(kuò)大范圍之勢(shì)，近年來(lái)該譜系的分離毒株越來(lái)越多[33]。另外，據(jù)Gao等[43]的認(rèn)為，2011年在我國(guó)新疆地區(qū)首次出現(xiàn)屬于譜系9的毒株，在進(jìn)化樹(shù)上形成獨(dú)立的小分支。

為控制我國(guó)暴發(fā)的HP-PRRSV，自2011年以來(lái)，多種HP-PRRSV減毒活疫苗(JXA1-P80、HuN4-F112、TJM-F92以及GDr180)被開(kāi)發(fā)和廣泛使用[44-47]，雖然對(duì)PRRS的防控起到了一定的作用，但由于人們對(duì)疫苗的過(guò)分依賴(lài)及無(wú)序使用，導(dǎo)致了疫苗毒在田間的持續(xù)流行和傳播，甚至出現(xiàn)了疫苗毒返強(qiáng)的現(xiàn)象，增加了不同毒株間重組的可能性，致使我國(guó)PRRS疫情更為復(fù)雜[41]。Jiang等[26]和Yu等[27]從豬場(chǎng)分離到的JXA1-P80和TJM-F92的返強(qiáng)毒株對(duì)仔豬具有致死性毒力。同譜系、不同譜系以及多個(gè)譜系之間的重組毒株越來(lái)越多，尤其是疫苗毒及其演化毒株與自然野毒株或新傳入毒株的重組現(xiàn)象值得特別關(guān)注。

3 展望

開(kāi)展PRRSV分子流行病學(xué)研究，深入探討和揭示PRRSV的遺傳演化規(guī)律，對(duì)PRRS的提前預(yù)警和及時(shí)防控具有非常重要的意義。由于毒種的多樣性、RNA病毒聚合酶的低保真性、免疫壓力，以及病毒之間的相互重組等多方面的的因素，PRRSV具有廣泛變異和快速演化的能力，變異株、新毒株層出不窮，30多年來(lái)，大量的PRRSV毒株被分離。此外，PRRSV減毒活疫苗在發(fā)揮其保護(hù)作用的同時(shí)也表現(xiàn)出了明顯的負(fù)面影響，疫苗返強(qiáng)毒株時(shí)有報(bào)道，而“鋪天蓋地”式的免疫策略使豬場(chǎng)內(nèi)病毒的本底加大，進(jìn)而導(dǎo)致疫苗毒株或疫苗演化毒株與自然野毒株之間的重組幾率大大增加，重組毒株越來(lái)越多。因此，盲目使用、過(guò)分依賴(lài)減毒活疫苗只能是一種惡性循環(huán)，這也十分不利于PRRSV的凈化工作。對(duì)于PRRS的防控，重視豬場(chǎng)的內(nèi)外部生物安全仍是根本之策，合理使用疫苗(陰性場(chǎng)不使用疫苗，一個(gè)場(chǎng)僅使用一種疫苗等)，加強(qiáng)引種時(shí)的隔離檢測(cè)，適當(dāng)采取活毒馴化、閉群、清群和種群更新等控制措施，減少PRRSV的傳播、延緩變異與演化的速度，從而降低疫情發(fā)生的概率。