• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    湖羊PGR基因?qū)β雅蓊w粒細胞體外增殖與凋亡的影響

    2021-04-13 05:58:08黃欣愛王潔陳明劉海霞姚曉磊李曉丹
    畜牧與獸醫(yī) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:湖羊顆粒細胞卵泡

    黃欣愛,王潔,陳明,劉海霞,姚曉磊,李曉丹

    (1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物科技學院,江蘇 泰州 225300;2.揚州大學動物科學與技術(shù)學院,江蘇 揚州 225009;3.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)

    雌性動物的排卵是一個復雜的生理過程,涉及到機體卵巢卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟等功能。已證實,孕酮(progesterone,P4)是排卵過程中一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[1]。P4可通過基因組與非基因組兩個層面發(fā)揮其生理學功能。其中,基因組層面生物學功能的發(fā)揮需通過與孕酮受體(progesterone receptor,PGR)結(jié)合得以實現(xiàn)。研究表明,PGR是參與調(diào)控排卵的重要調(diào)節(jié)因子,在卵泡破裂和卵母細胞釋放中起介導作用[2-3]。因此,在雌性動物生殖研究中探討PGR調(diào)控卵泡發(fā)育的作用機理顯得尤為重要。為揭示PGR在卵泡發(fā)育及排卵發(fā)生過程中的作用,前期研究者圍繞人[4]、小鼠[5-6]、豬[7-8]、恒河猴[2]的卵巢開展部分工作,發(fā)現(xiàn)PGR蛋白主要定位于卵巢卵泡顆粒細胞中。同時,研究者在敲除小鼠[5]、斑馬魚[9]、大鼠[10]和恒河猴[2]PGR基因后,發(fā)現(xiàn)它們均不能正常排卵。研究人員在敲除PGR的小鼠模型中進一步發(fā)現(xiàn),PGR能夠調(diào)控其下游排卵相關(guān)基因(ADAMTS1、PPAR-γ和CTSL)的表達[ 5-6,11-12],從而影響優(yōu)勢卵泡的破裂和卵母細胞的釋放。前期的研究還發(fā)現(xiàn),PGR基因在不同大小卵泡中差異表達[7],提示PGR可能參與卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于PGR基因的研究主要集中在嚙齒類和哺乳動物上,但PGR在反芻動物(尤其是湖羊)中是如何發(fā)揮作用的鮮有報道。因此,為進一步探究PGR基因影響湖羊顆粒細胞增殖的作用機制,本研究在克隆并分析湖羊PGR基因的編碼區(qū)序列 (coding sequence,CDS) 的基礎(chǔ)上,探究PGR對湖羊顆粒細胞生物學功能的影響,明晰PGR基因在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中的作用,旨在為挖掘湖羊多胎候選基因提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集主要試劑和儀器

    從江蘇省丹陽市珥陵屠宰場采集非妊娠湖羊卵巢,采集時間為每年11月份至次年2月份,樣品用于分離顆粒細胞。

    兔抗PCNA(Ab15497),購自Abcam,Cambridge,英國,1∶1 000;兔抗BAX(50599-2-lg),購自ProteinTech,Chicago,IL,美國,1∶1 000;羊抗IgG(SA00001-2),購自ProteinTech,Chicago,IL,美國,1∶4 000;兔抗β-actin(bs-0061R),購自Bioss,中國北京,1∶2 000;Trizol Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen,美國;Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa,中國大連;核酸蛋白測定儀ND-2000購自NanoDrop Technologies,美國)。

    1.2 引物設(shè)計

    引物序列及其產(chǎn)物大小見表1。

    表1 引物序列

    根據(jù)GenBank中綿羊PGR基因的序列(登錄號:XM_015100878.2),采用Primer 5.0軟件設(shè)計出擴增引物,湖羊PGR基因CDS區(qū)的引物和相關(guān)基因的定量引物序列。

    1.3 cDNA片段擴增

    使用實驗室前期保存(-80 ℃)的湖羊卵巢RNA,進行PGR基因的擴增。反應(yīng)條件為:95 ℃預變性3 min;98 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán),最后72 ℃再延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,切膠回收嚴格按照膠回收試劑盒說明書進行。將擴增的基因片段連接到pMD19-T載體上,進一步轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中,經(jīng)藍白斑篩選和菌液PCR檢測后,挑取陽性克隆進行測序。

    1.4 序列分析

    利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行拼接,獲得目的基因CDS區(qū)序列。通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) 在線軟件,找到該序列的起始和終止密碼子。采用DNAMAN軟件中的蛋白質(zhì)翻譯程序,得到湖羊PGR基因編碼氨基酸的序列。通過BLAST方法在NCBI中搜索同源序列,并與其他物種的編碼氨基酸的序列進行同源性分析。

    依據(jù)上述獲得的湖羊PGR基因CDS區(qū)序列,由上海吉瑪生物制藥有限公司合成過表達載體和干擾siRNA,其序列見表2。

    表2 PGR的干擾序列

    1.5 卵泡顆粒細胞的分離培養(yǎng)

    將卵巢保存于含有雙抗的37 ℃生理鹽水中,3 h內(nèi)運回實驗室。用含有雙抗的生理鹽水沖洗卵巢3~5次后去除卵巢系膜;用5 mL注射器預先吸入1 mL含有1% 胎牛血清(Fetal Calf Serum,F(xiàn)BS)的杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,DPBS),在超凈臺內(nèi)抽取2~5 mm健康卵泡的卵泡液,并將卵泡液收集置于15 mL無菌離心管中;1 500g離心5 min,用DPBS清洗1次,加入500 μL透明質(zhì)酸酶(0.3%),輕輕吹打混勻,再加入5 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM/F12),1 500g離心5 min,最后用6 mL完全培養(yǎng)基重懸,進行后續(xù)細胞培養(yǎng)。

    1.6 細胞轉(zhuǎn)染

    將分離的湖羊顆粒細胞以適宜密度接種于6孔板中,細胞密度長到60%~70%時,將PGR基因的干擾siRNA和過表達載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞,同時設(shè)置基礎(chǔ)對照組(BC),-80 ℃保存。

    1.7 細胞活力檢測

    將分離的湖羊顆粒細胞以適宜密度接種于96孔板中,將構(gòu)建好的PGR基因干擾siRNA和過表達載體轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后,每孔加入10 μL CCK8試劑,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,同時設(shè)置基礎(chǔ)對照組(BC)。

    1.8 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

    按照TRIzol Reagent試劑盒說明書提取上述顆粒細胞的總RNA,核酸蛋白測定儀ND-2000測定總RNA的濃度和純度;按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄,cDNA置于-20 ℃保存。

    1.9 qRT-PCR檢測

    以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進行周期和凋亡相關(guān)基因的qRT-PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL。SYBR Green Master mix (Roche,德國)10 μL,上、下游引物各0.6 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件和操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

    1.10 Western blot檢測

    從-80 ℃冰箱取出樣品,用添加有蛋白酶抑制劑(PMSF)的裂解液(RIPA)提取蛋白,按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒和蛋白變性試劑盒操作說明進行蛋白濃度的測定和變性。蛋白變性條件為70 ℃作用10 min,蛋白上樣量為30 μg。SDS-PAGE電泳采用10%預制膠,200 V,30 min。轉(zhuǎn)膜條件為100 V,1 h。5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h,孵育兔抗PCNA、兔抗BAX和兔抗β-actin多克隆一抗,4 ℃過夜。TBST搖床上洗3次,每次10 min;羊抗兔IgG室溫孵育1 h,TBST搖床上洗3次,每次10 min,電化學發(fā)光(ECL)顯影并觀察。用Image J軟件對其灰度值進行分析。

    1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    所有試驗均重復至少3次。使用SPSS 24.0(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示。采用單因素方差(one-way ANOVA)檢驗其差異顯著性,P<0.05表示差異顯著。應(yīng)用Graph Pad Prism 5軟件進行繪圖。

    2 結(jié)果

    2.1 湖羊PGR基因CDS區(qū)序列分析

    湖羊PGR基因CDS區(qū)全長為2 736 bp,編碼911個氨基酸。

    進一步采用DNAMAN軟件與其他物種編碼氨基酸的同源性進行分析,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn),湖羊PGR基因編碼氨基酸序列與山羊、牛、人、小鼠、大鼠、豬、雞的同源性分別為:95.44%、89.18%、78.37%、39.66%、73.91%、81.44%和52.49%(圖1)。

    圖1 不同物種PGR編碼氨基酸序列比對

    2.2 PGR基因?qū)蝾w粒細胞體外增殖的影響

    在湖羊顆粒細胞中,干擾和過表達PGR基因后,CCK8法檢測細胞增殖情況,結(jié)果見圖2。

    柱形圖上小寫字母不同,表示基因表達水平差異顯著,P<0.05。下同圖2 PGR基因?qū)蝾w粒細胞體外增殖的影響

    由圖2可看出,干擾PGR基因能夠顯著抑制顆粒細胞的增殖(P<0.05)。相反,過表達PGR基因則能顯著促進顆粒細胞的增殖(P<0.05)。

    2.3 PGR基因?qū)蝾w粒細胞周期和凋亡相關(guān)基因表達水平的影響

    干擾PGR基因可顯著下調(diào)顆粒細胞中CDK4、Bcl-2基因mRNA的表達,見圖3A和圖3E(P<0.05),上調(diào)顆粒細胞中Caspas3、Caspase8和BAX基因mRNA的表達見圖3C、圖3D和圖3F(P<0.05),但對CyclinD1未產(chǎn)生影響(圖3B,P>0.05);相反,過表達PGR可顯著上調(diào)CDK4、CyclinD1和Bcl-2基因mRNA的表達見圖3A、圖3B和圖3E(P<0.05),而顯著下調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX基因mRNA的表達,見圖3C和圖3D(P<0.05)。同時,干擾PGR基因分別顯著下調(diào)和上調(diào)顆粒細胞中PCNA和BAX蛋白表達水平,見圖4A(P<0.05);相反,過表達PGR基因則分別顯著上調(diào)和下調(diào)顆粒細胞中PCNA和BAX的蛋白表達水平,見圖4B、圖4C、圖4D(P<0.05)。

    A.CDK4;B.CyclinD1;C.Caspase8;D.Caspase3;E.Bcl-2;F.BAX圖3 PGR基因?qū)χ芷诤偷蛲鱿嚓P(guān)基因表達的影響

    A.干擾PGR基因;B、C、D.過表達PGR基因圖4 PGR對BAX和PCNA蛋白表達水平的影響

    3 討論

    為揭示PGR基因在湖羊卵泡發(fā)育中的作用機制,本研究首先克隆了湖羊PGR基因的CDS區(qū)序列,序列長度為2 736 bp,編碼911個氨基酸,與NCBI上預測的序列一致,這為本研究后續(xù)構(gòu)建PGR基因過表達載體和干擾siRNA奠定基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)鯉魚PGR基因編碼628個氨基酸[12]。經(jīng)同源性比對,發(fā)現(xiàn)與山羊、牛具有較高的同源性,相似度達到89%以上,表明PGR基因在反芻動物中高度保守。提示PGR基因可能在反芻動物中具有相似的功能。

    在對豬[6-7]、小鼠[4-5]、人[3]和恒河猴[2]的研究中,發(fā)現(xiàn)PGR在卵巢顆粒細胞中的表達。在牛不同大小卵泡中均檢測到PGR基因的表達,且表達有差異[6]。在湖羊中也證實了這一點,即PGR基因在湖羊不同大小卵泡中表達存在差異性。提示PGR可能參與湖羊卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié),但具體機制尚不清楚。

    顆粒細胞的增殖與凋亡與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[13-14]。為揭示PGR基因在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育中的作用,研究者通過采用PGR拮抗劑處理人和大鼠排卵前顆粒細胞,發(fā)現(xiàn)PGR拮抗劑能夠促進顆粒細胞凋亡[15-18]。Friberg等[19]在大鼠上也證實,PGR能夠介導排卵前顆粒細胞的凋亡。Cheng等[20]研究發(fā)現(xiàn),過表達PGR基因能夠促進結(jié)腸平滑肌細胞的活力。本研究發(fā)現(xiàn)干擾PGR基因能夠抑制湖羊顆粒細胞的增殖,而過表達則促進顆粒細胞的增殖,這與前期研究一致。但是,也有研究發(fā)現(xiàn)干擾PGR基因能夠促進永生化子宮內(nèi)膜細胞的增殖[21]。這提示,造成這種差異的產(chǎn)生的原因,可能與細胞類型及細胞狀態(tài)有關(guān)。

    細胞增殖和凋亡是一個極為復雜的過程,其中細胞周期和凋亡基因在其中扮演著重要角色[22-26]。本研究發(fā)現(xiàn),PGR基因?qū)φ{(diào)控顆粒細胞增殖與凋亡有一定的作用,干擾PGR基因能夠上調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX和下調(diào)CDK4、Bcl-2、PCNA基因或蛋白的表達水平;過表達PGR基因能夠下調(diào)Caspase3、Caspase8、BAX和上調(diào)CDK4、CyclinD1、Bcl-2、PCNA基因或蛋白的表達水平。對牛排卵前顆粒細胞的研究發(fā)現(xiàn),PGR能夠通過下調(diào)CyclinD2和下調(diào)P27基因的表達水平,促進牛顆粒細胞的凋亡[24,26]。Friberg等[18]也報道,PGR拮抗劑通過增強Caspase3的活力,進而促進大鼠顆粒細胞的凋亡。在人和小鼠顆粒細胞中也證實了這一點[15,27]。以上研究結(jié)果表明,PGR基因通過調(diào)控細胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達,進而影響顆粒細胞的增殖與凋亡。

    4 結(jié)論

    湖羊PGR基因CDS區(qū)序列長度為2 736 bp,編碼911個氨基酸,與山羊和牛的同源性較高。PGR基因通過調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡關(guān)鍵基因的表達,影響湖羊顆粒細胞的增殖與凋亡,進而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育。

    猜你喜歡
    湖羊顆粒細胞卵泡
    5G助力“智慧畜牧” 湖羊有了“健康碼”
    湖羊“地位”及“后時代”應(yīng)對策略
    MicroRNA調(diào)控卵巢顆粒細胞功能的研究進展
    湖羊的養(yǎng)殖探究——以金昌湖羊養(yǎng)殖為例
    促排卵會加速 卵巢衰老嗎?
    小鼠竇前卵泡二維體外培養(yǎng)法的優(yōu)化研究
    大腿肌內(nèi)顆粒細胞瘤1例
    補腎活血方對卵巢早衰小鼠顆粒細胞TGF-β1TGF-βRⅡ、Smad2/3表達的影響
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:22
    湖羊巴氏桿菌病診治病例
    卵巢卵泡膜細胞瘤的超聲表現(xiàn)
    久久精品国产综合久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人欧美| 激情视频va一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 大片免费播放器 马上看| 一区二区三区精品91| 男女免费视频国产| 精品福利永久在线观看| 99riav亚洲国产免费| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产黄频视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 日韩人妻精品一区2区三区| 在线永久观看黄色视频| 亚洲avbb在线观看| 1024视频免费在线观看| 久9热在线精品视频| 热99re8久久精品国产| 亚洲综合色网址| 黑人猛操日本美女一级片| 99九九在线精品视频| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲午夜理论影院| 午夜免费成人在线视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费不卡黄色视频| 99九九在线精品视频| 韩国精品一区二区三区| 国产av精品麻豆| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 多毛熟女@视频| 日本wwww免费看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一区二区三区激情视频| 国产精品免费视频内射| 超碰成人久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本黄色视频三级网站网址 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲人成电影观看| 捣出白浆h1v1| 捣出白浆h1v1| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 黄色视频不卡| 欧美在线一区亚洲| 性少妇av在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一级毛片女人18水好多| 无限看片的www在线观看| 午夜两性在线视频| 中文字幕制服av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲成人免费电影在线观看| 乱人伦中国视频| 久久久国产欧美日韩av| 热99久久久久精品小说推荐| 日本a在线网址| 操出白浆在线播放| 午夜激情久久久久久久| 91老司机精品| 国产精品欧美亚洲77777| 午夜免费鲁丝| 99国产精品一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 又紧又爽又黄一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 考比视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 91国产中文字幕| 久久久久视频综合| 波多野结衣一区麻豆| 大码成人一级视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91九色精品人成在线观看| av电影中文网址| 国产精品久久久久久精品古装| 国产日韩欧美在线精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| av福利片在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 女人精品久久久久毛片| www.精华液| 最近最新中文字幕大全电影3 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 欧美黄色淫秽网站| 国产精品久久电影中文字幕 | 大码成人一级视频| svipshipincom国产片| 多毛熟女@视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 色综合婷婷激情| 国产精品久久久久成人av| 女同久久另类99精品国产91| 午夜精品国产一区二区电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品久久久av美女十八| 91成人精品电影| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 1024香蕉在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 人妻久久中文字幕网| 在线观看免费高清a一片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美日韩亚洲高清精品| 在线观看免费视频网站a站| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费看十八禁软件| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 美国免费a级毛片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男人舔女人的私密视频| 精品一区二区三卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久亚洲真实| 人妻久久中文字幕网| 精品国产一区二区久久| bbb黄色大片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品国产国语对白av| 日韩一区二区三区影片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 视频在线观看一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 一区在线观看完整版| 在线av久久热| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜两性在线视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品久久电影中文字幕 | 韩国精品一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 久久精品国产综合久久久| 成年动漫av网址| 成人手机av| 黑人操中国人逼视频| 午夜福利欧美成人| 欧美日韩福利视频一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成年人免费黄色播放视频| 日韩大片免费观看网站| 婷婷成人精品国产| 男女免费视频国产| 国产1区2区3区精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色视频在线一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产在线观看jvid| 丝袜人妻中文字幕| 精品少妇内射三级| 在线观看免费视频网站a站| 国产av又大| 看免费av毛片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产在线精品亚洲第一网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 大型av网站在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 97在线人人人人妻| 国产精品 国内视频| 久久久久久久久免费视频了| 精品人妻1区二区| 1024视频免费在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产又爽黄色视频| 免费看十八禁软件| 亚洲伊人久久精品综合| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 桃花免费在线播放| 9热在线视频观看99| www.999成人在线观看| 国产麻豆69| 久热爱精品视频在线9| 国产三级黄色录像| 制服诱惑二区| 天堂8中文在线网| videos熟女内射| 免费看十八禁软件| 欧美国产精品一级二级三级| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲久久久国产精品| 国产黄色免费在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 人妻一区二区av| 国产97色在线日韩免费| 中文亚洲av片在线观看爽 | 两人在一起打扑克的视频| 手机成人av网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 777米奇影视久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 黄片播放在线免费| 一个人免费看片子| 久久性视频一级片| 亚洲专区字幕在线| 人妻一区二区av| 老司机午夜福利在线观看视频 | a级毛片在线看网站| 成人精品一区二区免费| 考比视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 麻豆成人av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产高清国产精品国产三级| 新久久久久国产一级毛片| 久久性视频一级片| 国产精品熟女久久久久浪| 捣出白浆h1v1| 国产精品久久电影中文字幕 | 成年动漫av网址| 三级毛片av免费| 国产亚洲av高清不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久人妻av系列| 亚洲欧美色中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精华国产精华精| 中文字幕高清在线视频| 一进一出好大好爽视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 考比视频在线观看| 桃花免费在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 电影成人av| 美国免费a级毛片| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品 欧美亚洲| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美乱妇无乱码| 美女国产高潮福利片在线看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品第一国产精品| 午夜福利欧美成人| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美在线一区亚洲| 丰满少妇做爰视频| 日本黄色日本黄色录像| √禁漫天堂资源中文www| 97在线人人人人妻| 成人黄色视频免费在线看| 午夜激情av网站| 久久中文字幕人妻熟女| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品亚洲av一区麻豆| 三上悠亚av全集在线观看| 超色免费av| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av电影在线进入| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产又爽黄色视频| 精品久久久久久电影网| 老汉色∧v一级毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 一本综合久久免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜福利欧美成人| 女人精品久久久久毛片| 亚洲国产成人一精品久久久| 高清毛片免费观看视频网站 | 免费av中文字幕在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黄色片一级片一级黄色片| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 午夜91福利影院| 成年人免费黄色播放视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品一品国产午夜福利视频| 首页视频小说图片口味搜索| 男人舔女人的私密视频| 亚洲天堂av无毛| 国产日韩欧美视频二区| 91av网站免费观看| 色综合婷婷激情| 啦啦啦 在线观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩欧美一区视频在线观看| 99热网站在线观看| 999久久久国产精品视频| tocl精华| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| www日本在线高清视频| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 大片免费播放器 马上看| 日韩三级视频一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品一区二区精品视频观看| 多毛熟女@视频| 美女国产高潮福利片在线看| 国产不卡av网站在线观看| 成人手机av| 国产精品九九99| bbb黄色大片| 99久久99久久久精品蜜桃| 美女午夜性视频免费| 亚洲五月婷婷丁香| 色播在线永久视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 757午夜福利合集在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩av久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲国产av新网站| 成年版毛片免费区| 久久久久精品人妻al黑| 婷婷丁香在线五月| 国产一区二区三区视频了| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 中文字幕人妻丝袜制服| 精品高清国产在线一区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 大香蕉久久成人网| 99精品在免费线老司机午夜| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 久久av网站| 两人在一起打扑克的视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 老司机影院毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 国产不卡一卡二| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 女警被强在线播放| 12—13女人毛片做爰片一| 日本av免费视频播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 91国产中文字幕| 国产日韩欧美视频二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲三区欧美一区| 91国产中文字幕| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 老汉色∧v一级毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品成人在线| 亚洲精品国产区一区二| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩福利视频一区二区| 91字幕亚洲| 一区二区av电影网| 亚洲少妇的诱惑av| 两人在一起打扑克的视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 热re99久久国产66热| 国产精品 欧美亚洲| 成人特级黄色片久久久久久久 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 自线自在国产av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 丝袜喷水一区| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩精品网址| 大陆偷拍与自拍| 精品一区二区三区av网在线观看 | 麻豆av在线久日| 9191精品国产免费久久| 一区福利在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 1024香蕉在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产av精品麻豆| 老司机亚洲免费影院| 亚洲一码二码三码区别大吗| 九色亚洲精品在线播放| 超色免费av| 12—13女人毛片做爰片一| 人人妻人人澡人人看| 精品亚洲成a人片在线观看| 91麻豆av在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 9191精品国产免费久久| 黄频高清免费视频| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av国产av综合av卡| 蜜桃国产av成人99| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| av线在线观看网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产麻豆69| 丁香欧美五月| 在线播放国产精品三级| 十八禁网站免费在线| 久久 成人 亚洲| 久久久久久久久免费视频了| 精品人妻在线不人妻| 国产精品 欧美亚洲| 宅男免费午夜| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲成人免费电影在线观看| 女警被强在线播放| 天天影视国产精品| 最新美女视频免费是黄的| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲国产欧美网| 中文字幕人妻丝袜制服| av免费在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 日韩免费av在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 日本欧美视频一区| 9色porny在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 手机成人av网站| 超色免费av| 亚洲 国产 在线| 久久久久视频综合| 亚洲,欧美精品.| 精品少妇内射三级| 亚洲黑人精品在线| 老汉色∧v一级毛片| 久久这里只有精品19| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品国产国语对白av| 交换朋友夫妻互换小说| 老司机靠b影院| 十分钟在线观看高清视频www| 美女午夜性视频免费| 国产精品久久电影中文字幕 | 大香蕉久久网| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 大型av网站在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 热99re8久久精品国产| 少妇精品久久久久久久| 国产一区二区 视频在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久 成人 亚洲| 日本a在线网址| 一本久久精品| 18在线观看网站| 91字幕亚洲| 少妇的丰满在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 9191精品国产免费久久| 最近最新免费中文字幕在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品久久电影中文字幕 | 90打野战视频偷拍视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 麻豆国产av国片精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久人妻av系列| 99精国产麻豆久久婷婷| 女性被躁到高潮视频| 国产av又大| 99久久人妻综合| 黑人猛操日本美女一级片| 女人久久www免费人成看片| 色老头精品视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 久久久国产欧美日韩av| 久久久精品94久久精品| 99在线人妻在线中文字幕 | av欧美777| 亚洲色图综合在线观看| 在线看a的网站| 亚洲精品中文字幕在线视频| 又大又爽又粗| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久毛片免费看一区二区三区| av天堂久久9| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲一区二区三区欧美精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 真人做人爱边吃奶动态| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品久久久精品久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产日韩欧美视频二区| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲少妇的诱惑av| 丰满迷人的少妇在线观看| 香蕉丝袜av| 手机成人av网站| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲 欧美一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一区二区三区乱码不卡18| 夜夜爽天天搞| 国产日韩欧美视频二区| 一区在线观看完整版| 成人av一区二区三区在线看| 免费在线观看黄色视频的| 成人国产一区最新在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 色在线成人网| av网站在线播放免费| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| 青草久久国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 午夜老司机福利片| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲avbb在线观看| 欧美黑人精品巨大| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品二区激情视频| 国产99久久九九免费精品| 国产免费现黄频在线看| 大片免费播放器 马上看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品一区二区精品视频观看| 最新的欧美精品一区二区| 午夜两性在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲免费av在线视频| h视频一区二区三区| 伦理电影免费视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 丝袜美足系列| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久精品电影小说| 这个男人来自地球电影免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 99久久国产精品久久久| 国产精品久久久av美女十八| www.熟女人妻精品国产| 深夜精品福利| 精品少妇内射三级| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产黄频视频在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 极品人妻少妇av视频| 久久狼人影院| 最新美女视频免费是黄的| 91成年电影在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人免费观看mmmm| 国产91精品成人一区二区三区 | 18禁美女被吸乳视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 中文字幕最新亚洲高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品影院久久| 黄色怎么调成土黄色| 欧美在线一区亚洲| 亚洲全国av大片|