水性組織透明化技術(shù)的研究進展與應(yīng)用

吳昊妍 詹琰靜 張士文，2

0 引言

機體由不同的組織和器官構(gòu)成，并借由器官間的互相協(xié)作來完成生命活動。因此，了解器官和組織的精細結(jié)構(gòu)對于進一步明確生命代謝機制及疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用。此外，發(fā)育生物學需要研究者在三維空間下理解組織器官的生長發(fā)育。因此，隨著顯微成像技術(shù)的應(yīng)用，組織器官的三維成像受到了廣泛的關(guān)注。

目前顯微成像技術(shù)雖然極大地增加了成像深度，但對于較厚組織深部結(jié)構(gòu)的觀測仍舊有限。如電子計算機斷層掃描，雖然其可以對體積較大的組織進行完整成像，但它們空間分辨率較低，無法實現(xiàn)單細胞的成像，且成像深度有限。除此之外，組織中的色素會吸收可見光進而阻擋入射光和激發(fā)光，組織的內(nèi)源性熒光或在樣本操作過程中所產(chǎn)生的熒光信號會干擾組織觀測，半透明或乳白色的生物組織外觀也會使圖像信噪比降低而影響深部成像。為解決成像深度的問題，組織透明化技術(shù)應(yīng)運而生，它可在一定程度上降低組織的散射率并緩解組織光吸收。

目前，許多科研工作者致力于探索和改進各種透明化方法，如iDISCO、uDISCO、PEGASOS及CUBIC、PACT、ScalsS(2015)、Ce3D等，以期獲得一套全組織高分辨率(至少細胞級分辨率)成像的解決方案。組織透明化技術(shù)有多種分類方法，本文按照主流分類方法將其分為油性透明化技術(shù)和水性透明化技術(shù)，并對水性透明化技術(shù)的被動浸潤法、水化法和水凝膠嵌入法三類方法進行綜述。

1 被動浸潤法水性透明化技術(shù)

被動浸潤法水性透明化技術(shù)是指將組織浸泡在高折射率(>1.45)溶液中并置于適宜的溫度下孵育，利用滲透壓使組織逐漸透明化。該方法不去除脂質(zhì)，利用高折射率溶液替換組織內(nèi)外的液體，以平衡折射率。此法常應(yīng)用于較小樣本的透明化處理。目前報道的被動浸潤法水性透明化技術(shù)主要有以下幾種。

1.1 ClearT/ClearT2、ReagentTF

ClearT/ClearT2是Kuwajima 等[5]為了更好地觀察小鼠的神經(jīng)元及非神經(jīng)元組織，發(fā)明的基于甲酰胺的組織透明化方法，通過組織透明化技術(shù)結(jié)合光學成像來觀察腦部結(jié)構(gòu)及全腦的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是研究腦組織的重要手段。此技術(shù)結(jié)合組織標記技術(shù)可成功地對小鼠胚胎及幼鼠的大腦進行成像。

ClearT成像效果好，速度快，并能與脂溶性示蹤劑和熒光示蹤劑兼容。但該法會使樣本略微膨脹，且會使樣本熒光信號淬滅。聚乙二醇 (polyethylene glycol，PEG)可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，繼而發(fā)展了可保留免疫組化和基因編碼的熒光蛋白的ClearT2技術(shù)，但其組織透明度比ClearT低，透明化能力受限，無法處理幼鼠全腦或成年鼠腦組織。

ReagentTF是汪建茹等[6]在ClearT基礎(chǔ)上引入三乙醇胺試劑，發(fā)展的能與多種標記方法兼容的技術(shù)。其操作更簡便，成像更好，對樣本結(jié)構(gòu)的保護效果更優(yōu)，解決了ClearT2處理樣本后熒光信號隨著時間減弱的缺點，更好地保持了樣本熒光信號甚至有所提升。通過ReagentTF技術(shù)，可清晰觀測到樹突棘和軸突等精細結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路的可視化，并進行神經(jīng)元的長程投射追蹤。

1.2 SeeDB、UbasM、FRUIT

Ke等[7]發(fā)明了SeeDB(see deep brain)技術(shù)，它以果糖和0.5%α-硫代甘油飽和溶液為主要成分，能在幾天內(nèi)將樣本透明化。經(jīng)SeeDB處理的腦切片樣本能有效透明化大腦灰質(zhì)和白質(zhì)，且樣本完整性好，體積變化小。其可以與免疫組織化學結(jié)合，并與親脂性示蹤劑細胞膜紅色熒光探針(DiI)兼容，有助于腦部神經(jīng)回路的研究。SeeDB因高濃度果糖黏度大導致其在組織內(nèi)的滲透性較低。即使動脈灌注可以促進SeeDB在腦部的擴散，但其極高的黏度使其很難應(yīng)用于較大的哺乳動物。通過加熱至50℃可以增加其滲透性，但由于美拉德效應(yīng)導致褐變和自熒光積聚，熒光蛋白淬滅，從而影響樣本的透明化。

SeeDB用于研究腦部神經(jīng)回路，因此可以利用其研究死后大腦樣本中的神經(jīng)元連接。目前也有學者利用SeeDB實現(xiàn)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的可視化[8]，對眼睛進行定性定量研究。

Chen等[9]發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)具有很好的化學促滲功能，在SeeDB的基礎(chǔ)上加入DMSO加速試劑進入組織，以提高透明化效率。該技術(shù)被命名為UbasM，可在1 h內(nèi)處理1 mm腦切片，7 d內(nèi)實現(xiàn)小鼠半腦透明化，還可使心臟、肝臟等透明化，其中對腸的透明化速率是最快的。在疾病研究方面，UbasM不僅可以結(jié)合免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于老年癡呆的研究，還可以結(jié)合共聚焦顯微鏡對帶有熒光標記的腫瘤細胞及組織器官進行觀察。

由于SeeDB黏度極高，Hou等[10]在SeeDB基礎(chǔ)上衍生了一種透明化方法FRUIT。該法選擇尿素作為試劑中另一主要成分，降低了果糖黏度，大大提高試劑流動性和滲透性，加速了試劑在組織中的擴散速率，可結(jié)合動脈灌注實現(xiàn)較大哺乳動物的全腦透明化。

1.3 TDE

TDE是Staudt等[11]開發(fā)出的一種可改變折射率以適用所有油鏡鏡頭的低成本、低毒性的透明化技術(shù)，此技術(shù)可解決成像組織與油鏡的折射率不匹配導致成像效果降低的問題。TDE在腦組織中的擴散速度快，可在數(shù)月內(nèi)保存熒光蛋白，而且不會引起組織變形。其不僅實現(xiàn)了小鼠大腦和人腦組織的透明化，還實現(xiàn)了對植物組織擬南芥生殖細胞的透明化。

由于TDE在高濃度時會降低熒光強度，限制成像深度，將來的發(fā)展方向主要是針對于增加樣本透明化深度，并擴大除腦組織外對于其他組織器官的應(yīng)用。

1.4 FocusClear

FocusClear 是Liu等[12]發(fā)明的透明化技術(shù)。其以昆蟲蟑螂大腦為實驗樣本，采用二乙酰胺基三碘苯甲酸作為主要透明化試劑，提高了組織結(jié)構(gòu)的圖像分辨率，輔助共聚焦顯微鏡可觀察細胞間的相互作用，并且能與熒光染色劑和基因綠色熒光蛋白兼容。除此之外，F(xiàn)ocusClear的透明化過程可逆，操作時可以將樣本置于PBS中保存或繼續(xù)處理。FocusClear目前用于昆蟲腦的研究，但對于較大的樣本來說，成本昂貴，且不能針對不同的生物樣本進行改進優(yōu)化。

2 水化法水性透明化技術(shù)

水化法水性透明化技術(shù)是指在透明化過程中被動去除脂質(zhì)后，利用水合作用降低樣本折射率進而實現(xiàn)組織透明化。此方法中，透明化試劑中的尿素或甲酰胺可滲透進入高折射率的蛋白質(zhì)并使整體折射率降低。

2.1 Scale / ScaleS

Hama等[13]研發(fā)了Scale透明化技術(shù)。在尿素中混合甘油和Triton X-100制成Sclae A2試劑，在加快滲透速度的同時可完整保留標記細胞的熒光信號，對于重建組織細胞群有重要意義。將試劑成分改性得到Scale U2可減少組織擴張及脆性，但其操作時間長，對較大樣本的透明化效率較差。

Scale試劑不會導致熒光蛋白的淬滅，其材料易獲得且成本較低，可應(yīng)用于嚙齒類、小型哺乳類、靈長類動物及人體活組織樣本的成像。但此法操作時間較長，且易導致組織破碎，研究人員也根據(jù)這些特性對試劑成分比例進行不斷調(diào)整改進[14-15]。

Hama等[16]在Scale A2基礎(chǔ)上添加山梨醇制成改良試劑ScaleS，山梨醇可以使組織脫水收縮以中和由于尿素水化作用導致的樣本體積膨脹。目前研究者們利用ScaleS對患阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)或患AD死亡后的小鼠模型的大腦組織樣本進行透明化，并對神經(jīng)環(huán)路、淀粉樣斑塊、小膠質(zhì)細胞等進行三維重建等研究。

2.2 CUBIC

CUBIC是Susaki團隊[17]研發(fā)的一種新型水性透明化方法，其簡單、有效，能完好保存熒光信號，并與腦組織的免疫染色兼容，結(jié)合顯微成像技術(shù)能以單細胞分辨率進行全腦成像。其試劑基于Scale之上添加了氨基醇，它可以清除血紅素使組織脫色，因此能通過灌注來加速組織滲透和脫色。

目前可利用CUBIC結(jié)合熒光蛋白觀察神經(jīng)細胞的軸突或突觸連接，從而研究神經(jīng)元連接，隨著技術(shù)發(fā)展，其觀察范圍會從亞細胞結(jié)構(gòu)擴展到靈長類動物的腦組織。此外，Kubota等[18]利用CUBIC在單細胞水平上描繪了癌癥的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)umoto等[19]則利用CUBIC結(jié)合轉(zhuǎn)基因表達ZsGreen熒光蛋白完成了對肝臟及其他組織的觀察，并成功觀察了小鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)粒DNA。

2.3 OPTIClear

人腦與嚙齒動物大腦在理化性質(zhì)、神經(jīng)元組織等方面存在較大差異，并且不同人腦組織由于患者死前狀態(tài)不同，在死后發(fā)生變化的不同從而導致不同人腦組織也存在差異，這些阻礙了人腦組織的透明化技術(shù)發(fā)展[20-21]。Lai等[22]研發(fā)了OPTIClear，先將腦標本用福爾馬林液浸透，然后將腦標本在特定的溫度下進行螢光漂染，再用OPTIClear 把腦組織透明化。OPTIClear選擇性地調(diào)整組織的光學特性而不損壞或改變其結(jié)構(gòu)成分。另外，他們發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定組織可以被甲酚紫和凝集素染色，幫助顯示大腦神經(jīng)元及血管的三維排布，從而不需要經(jīng)過十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)脫脂處理就可以進一步利用OPTIClear進行透明化。

2.4 Ce3D

為了解在復雜生理病理環(huán)境下不同器官細胞之間的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，Gerner團隊發(fā)明了Ce3D技術(shù)[23-24]。Ce3D處理的樣本體積縮小但細胞形態(tài)完整，能與多種熒光蛋白和免疫標記兼容，可結(jié)合三維組織細胞術(shù)對不同類型的、高度混合的細胞群進行定量分析。

通過實驗，可觀察到Ce3D能對小鼠肺、腸、肝等組織及整段股骨進行有效透明化。除此之外，Gerner團隊利用Ce3D成功透明化成像人體組織的活檢樣本。最近研究發(fā)現(xiàn)Ce3D與RNA轉(zhuǎn)錄本檢測兼容，通過RNAscope檢測方法結(jié)合Ce3D抗體染色，可以進行細胞表型分析及對厚組織中的RNA轉(zhuǎn)錄物進行高質(zhì)量檢測。Bossolani等[25]認為Ce3D是實現(xiàn)小鼠腸段快速3D成像的最有效方法，其能幫助顯示胃腸壁內(nèi)神經(jīng)-免疫-血管交互網(wǎng)絡(luò)中的不同細胞亞群。

3 水凝膠嵌入法水性透明化技術(shù)

水凝膠嵌入法水性透明化技術(shù)是將樣本包埋在水凝膠中，使水凝膠與樣本中的蛋白質(zhì)和核酸分子形成共價連接以便固定和保護細胞結(jié)構(gòu)，再將樣本置于透明化試劑透明化試劑中，通過被動擴散或者電泳快速去除脂質(zhì)，最后將樣本置于高折射率溶液中進行透明化。

3.1 CLARITY

CLARITY是Chung等[26]發(fā)明的與傳統(tǒng)水性透明化方法不同的組織透明技術(shù)。該技術(shù)通過將配置好的水凝膠溶液灌注入小鼠體內(nèi)，使樣本轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂运z狀態(tài)，然后通過SDS對組織樣本進行洗滌，最后采用電泳的方式將緩沖液中包裹脂質(zhì)的SDS膠束從組織樣本中去除。CLARITY在光學透明的基礎(chǔ)上減少了熒光蛋白的淬滅，并且兼容大體積組織樣本的免疫熒光標記。Zheng等[27]對水凝膠的配置進行了改進，添加了丙烯醛以提高組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Tomer等[28]、Yang等[29]和Zhang[30]團隊都認為CLARITY的電泳步驟需要改進，他們將電泳改進為恒溫搖床操作被動除脂，但透明速率的削弱可能會降低成像深度，所以即使電泳步驟會導致組織結(jié)構(gòu)損傷及膨脹，但對于提高透明效率是必需的。

目前已有研究者將CLARITY應(yīng)用于多種神經(jīng)疾病的研究上，如自閉癥患者的神經(jīng)元細胞變化，灰質(zhì)萎縮癥的病因機制[31]， AD患者病變腦部Aβ、tau和神經(jīng)絲的三維結(jié)構(gòu)重建[32]，帕金森患者腦部死后病理狀態(tài)，線粒體疾病中神經(jīng)退行性變的機制[33]等。也有研究者將該技術(shù)應(yīng)用于各種器官組織。Lee等[34]改良了CLARITY技術(shù)，將其應(yīng)用于胰腺、肝等組織；Saritas等[35]借助其觀察到飲食中鉀元素缺乏會導致腎小管發(fā)生適應(yīng)性變化； Cronan等[36]借助其揭示了分枝桿菌引起腫瘤病變的病理機制，還獲得了肉芽腫瘤的三維可視化結(jié)構(gòu)； Font-Burgada等[37]借助其成功發(fā)現(xiàn)并定位轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的HybHP； Greenbaum等[38]研發(fā)了Bone CLARITY技術(shù)，實現(xiàn)小鼠椎體和長骨骨干的三維重建，為骨骼疾病病理基礎(chǔ)研究提供了新的思路。

3.2 PACT-PARS

為溫和快速地使整個生物體透明化， Treweek團隊[29，39]提出了PACT-PARS技術(shù)，他們使用了一種折射率耦合試劑，這種被動透明技術(shù)稱為PACT，運用于全身細胞的技術(shù)稱為PARS。Treweek團隊優(yōu)化了試劑，去除雙丙烯酰胺，配置8% SDS透明化試劑，用持續(xù)心臟壓力灌注取代ETC驅(qū)動，促進組織透明化并保存了熒光信號。

PACT-PARS技術(shù)可以應(yīng)用于嚙齒類動物的大多數(shù)器官及人體病理性活檢組織，結(jié)合細胞免疫組化技術(shù)和熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞甚至亞細胞結(jié)構(gòu)。Dabrowska團隊[40]利用PACT-PARS技術(shù)研究了在癲癇發(fā)作時海馬體到雙側(cè)皮質(zhì)運動的神經(jīng)通路狀況，并探究了癲癇發(fā)作時神經(jīng)傳播路徑及逆行性遺忘的病理機制。但PACT-PARS技術(shù)是利用生物體體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)將試劑擴散到整個組織，由于各個組織血管網(wǎng)分布不均勻，所以不同器官透明化的程度和速度也不盡相同。

3.3 SHIELD

為實現(xiàn)組織的透明化，學者們往往會選擇生物酶、化學物質(zhì)、高溫等方法，即使采用水凝膠保護生物大分子，也無法避免結(jié)構(gòu)損傷。因此，Chung團隊[41-42]發(fā)明了SHIELD透明化技術(shù)，通過環(huán)氧化物PP3E(polyglycerol-3-polyglycidyl ether)固定組織實現(xiàn)保護蛋白的作用，之后未采取丙烯酰胺凝膠包埋組織，而是使用SDS進行被動或主動除脂，最后對組織進行透明化，解決了組織結(jié)構(gòu)和熒光蛋白的保護問題。借助SHIELD透明化技術(shù)，實現(xiàn)細胞水平的人腦組織塊的透明化及對臨床腦穿刺組織和單個神經(jīng)元以及其周圍突觸簇的成像。

3.4 SWTICH

SWITCH是Murray等[43]研究的一種基于戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)的新型透明化技術(shù)，GA不需要進行灌注即可滲透組織并形成均勻的組織凝膠，可應(yīng)用于動物及人體的大型組織，且步驟簡單。GA組織凝膠便于多輪免疫標記，在應(yīng)用SDS高溫脫脂后可實現(xiàn)組織樣本的快速透明，并且可以高度保護內(nèi)源性生物分子及其抗原性，保證結(jié)構(gòu)完整性，使組織損傷達到最小化。Murray 團隊利用SWTICH技術(shù)分析了人類皮質(zhì)組合蛋白譜，并成功實現(xiàn)小鼠脊髓髓鞘的可視化。然而該技術(shù)仍存在一些問題，如用GA固定組織會導致廣譜自發(fā)熒光的增加，由于mRNA在高溫下不穩(wěn)定，因此其與需要保留mRNA的方法不兼容，高溫可能會導致組織褐變等。盡管SWITCH可以處理大樣本，但標記速度仍然從根本上受到被動擴散的限制。

3.5 ACT-PRESTO

Lee等[44]開發(fā)了ACT-PRESTO技術(shù)來實現(xiàn)大型組織樣本的快速處理，并與免疫標記兼容，可標記深層結(jié)構(gòu)，操作簡單易行，有利于增加臨床上一些疾病的診斷速度。ACT-PRESTO技術(shù)分為兩個部分，即ACT主動透明化技術(shù)及PRESTO促進大分子滲透的步驟，能于數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)完成組織透明化。Dai等[45]利用皮神經(jīng)活檢技術(shù)結(jié)合ACT-PRESTO實現(xiàn)了周圍神經(jīng)纖維的三維成像。

4 總結(jié)與展望

與傳統(tǒng)的組織切片及二維成像技術(shù)相比，組織透明化技術(shù)實現(xiàn)了完整的組織或器官透明化，避免了組織切片對樣本的扭曲，提高了成像效率，因此具有良好的應(yīng)用前景。也可將此技術(shù)作為輔助方法用于疾病模型的診斷和建立。油性透明化技術(shù)由于需要脫水去脂，因此容易導致熒光蛋白的淬滅，而水性技術(shù)則可有效解決這一問題。

目前大多數(shù)水性透明化技術(shù)多應(yīng)用于軟組織的成像，對于硬組織的透明化研究及效果并不理想。除此之外，盡管透明化技術(shù)進一步加深了組織成像深度，但仍無法完美地應(yīng)用于大體積樣本，如人體組織器官的完整成像。因此針對大體積樣本的透明化仍是一個需要攻克的難題。在未來，水性透明化技術(shù)應(yīng)著重研究更先進的透明化試劑及方案以提高靈長類動物或人類組織器官的透明化效果，提升透明化速度的同時保留熒光蛋白，與脂溶性示蹤劑和免疫標記技術(shù)兼容，增加抗體滲透速率和深度，從而完善免疫標記，實現(xiàn)器官組織亞細胞分辨程度上的快速成像。未來水性透明化技術(shù)可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，為基礎(chǔ)科學的疾病機制的研究提供思路，為疾病的診斷提供精準的病理學依據(jù)，為需要靶向治療器官組織的定位提供幫助。