運動對大鼠慢性高眼壓視網(wǎng)膜自噬與凋亡的影響

龍曉雪 楊宏宇 薛艷麗 宋紅芳

0 引言

青光眼作為世界第一位不可逆致盲眼病，以視神經(jīng)萎縮、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、視盤凹陷為主要標(biāo)志性病變[1]。眼壓升高一直是青光眼最危險的因素之一，眼壓升高可導(dǎo)致RGCs的凋亡[2]。RGCs屬于高度分化的細(xì)胞，一旦凋亡便無法補(bǔ)充，因此阻止RGCs在高眼壓影響下的凋亡對于防治青光眼尤為重要。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬功能相關(guān)。細(xì)胞自噬，可以將細(xì)胞內(nèi)多余或受損細(xì)胞器包裹并送到溶酶體降解，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的再利用，通過大分子的分解代謝，產(chǎn)生代謝底物，滿足饑餓細(xì)胞的生物能量需求，從而允許適應(yīng)性蛋白質(zhì)的合成[3]。自噬可以與凋亡合作、協(xié)助或?qū)?，從而影響?xì)胞的不同命運，細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)定需要這兩種細(xì)胞死亡模式之間的相互平衡[4]。研究證明，在慢性高眼壓動物模型中，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表達(dá)增加，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層能看到自噬體的積累，說明慢性高眼壓使RGCs中自噬被激活[5-6]，并且RGCs在壓力作用下其自噬功能會先被激活來保護(hù)細(xì)胞，直至壓力達(dá)到激活凋亡的閾值，才引起細(xì)胞凋亡[7]。這些現(xiàn)象提示細(xì)胞自噬可能成為青光眼治療干預(yù)的新靶點。

已有研究表明，運動可以影響細(xì)胞的自噬與凋亡。一方面，規(guī)律的運動鍛煉可以降低凋亡水平，對于急性高眼壓模型[8-9]、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷模型[10-11]和糖尿病模型[12-13]，運動可以增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的含量水平促進(jìn)其表達(dá)，還能夠改善線粒體的功能，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少RGCs的凋亡，減緩視網(wǎng)膜功能的退化。另一方面，運動會引起細(xì)胞自噬的變化，根據(jù)發(fā)揮作用的不同，自噬有兩種變化趨勢：(1) 運動可激活細(xì)胞自噬。短期運動在導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的同時可以激活心肌細(xì)胞的自噬，而長期運動可以降低心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其自噬的激活以加強(qiáng)心肌的保護(hù)功能[14]。研究表明8周的抗阻訓(xùn)練可以刺激外周血單個核細(xì)胞自噬，阻止炎癥小體的激活，減少老年人外周血單個核細(xì)胞的凋亡[15]。Kwon等[16]提出運動誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)，運動能提高細(xì)胞自噬和抗氧化能力，增強(qiáng)合成代謝信號傳導(dǎo)，可能是一種有效對抗多種肝臟疾病的非藥物治療策略。(2) 運動可降低細(xì)胞自噬。體育鍛煉可以減少大鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型梗死周圍區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的自噬體積累、減少細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)神經(jīng)功能[17]。游泳運動可改善糖尿病誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮的肌肉質(zhì)量，這提示糖尿病中細(xì)胞自噬的激活通過高分解代謝促進(jìn)了肌肉萎縮，有氧運動通過抑制細(xì)胞自噬，可能改變或逆轉(zhuǎn)糖尿病患者的骨骼肌萎縮[18]。由上可見，運動對各部位細(xì)胞自噬的影響是多方面的。

目前運動對視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞自噬的作用還鮮有研究，尤其是慢性高眼壓環(huán)境下，運動對視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞自噬與凋亡的影響，還有待探索。因此本文對接受與不接受運動訓(xùn)練的慢性高眼壓動物模型進(jìn)行對比實驗，研究兩種模型視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞自噬與凋亡的發(fā)生水平，結(jié)合RGCs的存活數(shù)量，判斷細(xì)胞自噬發(fā)揮的作用，為青光眼的運動治療方法提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

選取8周齡雄性SD大鼠32只(體質(zhì)量260.00 g±20.00 g)，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白對照(control，CON)組、中度運動訓(xùn)練(moderate intensity training，MT)組、輕度運動訓(xùn)練(low intensity training，LT)組和靜置慢性高眼壓(chronic ocular hypertension，COH)組，每組8只。采用正常飲食喂養(yǎng)，12 h循環(huán)光照飼養(yǎng)。CON組不做任何處理；MT、LT、COH組為慢性高眼壓大鼠模型。本實驗得到首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 運動訓(xùn)練

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用大鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀(YLS-15A，上海玉研科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行運動訓(xùn)練，前3天采用由慢到快、逐漸加速訓(xùn)練，最終步速達(dá)到23 m/min。訓(xùn)練成功的標(biāo)準(zhǔn)是大鼠能夠以23 m/min的步速完成20 min不間斷跑步。隨后對MT、LT和COH組進(jìn)行高眼壓造模。造模后MT與LT組繼續(xù)接受每日運動訓(xùn)練，步速分別為23 m/min(約最大耗氧量70%)和17 m/min(約最大耗氧量58%)[19-20]，持續(xù)60 min，每日訓(xùn)練1次，每周訓(xùn)練5 d，持續(xù)3周。COH組不做任何運動訓(xùn)練。

1.3 慢性高眼壓模型建立

采用烙閉上鞏膜靜脈并在球結(jié)膜下注射25 mg/mL氟尿嘧啶(0.05 mL/只，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)的方法[21]使右眼眼壓升高，左眼不做處理。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)是左右眼壓差高于15 mmHg(1 mmHg=133.322 Pa)并維持3周。

1.4 檢測方法

1.4.1 Western blot檢測

采用頸椎脫臼法同時處死4組動物,每組各4只。取右眼視網(wǎng)膜，充分裂解，離心后取上清。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制15% 分離膠，濃縮膠濃度為5%。上樣8 μL，濃縮膠恒壓90 V，約120 min，分離膠恒壓120 V，約90 min。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜60 min后5%BSA-TBST封閉60 min。用5%BSA-TBST稀釋一抗LC3(1∶1000，CST)， 4 ℃水平搖床孵育過夜。次日5%BSA-TBST稀釋二抗(1∶10000，Jackson)孵育。ECL反應(yīng)液做發(fā)光底物，用X線膠片暗室曝光，掃描，用軟件Gel Image system ver.4.00 (tanon，中國)分析蛋白條帶灰度值。

1.4.2 免疫組化染色

每組各取4只右眼眼球進(jìn)行石蠟包埋切片。切片脫蠟、水化后浸入EDTA抗原修復(fù)液(北京中科萬邦生物科技有限公司)并加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，PBS沖洗后采用3%BSA對一抗LC3(1∶1000，CST)、Beclin1(1∶100，abcam)、Bax(1∶500，abcam)、Bcl-xl(1∶500，CST)、NeuN(1∶400，CST)進(jìn)行稀釋，37 ℃孵育60 min；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，37℃孵育20 min；滴加PBS稀釋的增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物(1∶500，Jackson)，37 ℃孵育20 min，DAB顯色后復(fù)染、封片與觀察。采用Image-Pro Plus 6.0(MEDIA CYBERNETICS，美國)軟件進(jìn)行圖像分析，以平均積分光密度值(mean of IOD)作為蛋白的陽性表達(dá)水平。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

通過IBM SPSS Statistics 25(IBM，美國)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若符合，統(tǒng)計方法采用單因素方差(one-way ANOVA)分析；若不符合，統(tǒng)計方法采用Kruskal-Wallis H 檢驗。若P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGCs數(shù)量

3周高眼壓模型眼壓結(jié)果如表1所示。與CON組相比，MT組、LT組、COH組造模右眼眼壓明顯高于正常眼眼壓，有統(tǒng)計學(xué)意義，壓差在15 mmHg左右，符合高眼壓模型標(biāo)準(zhǔn)。且MT、LT、COH三組間眼壓沒有統(tǒng)計學(xué)差異，符合單一變量的原則。各組大鼠RGCs的NeuN染色結(jié)果如圖1所示，定量分析結(jié)果如圖2所示。COH組RGCs數(shù)量低于CON組，經(jīng)過運動訓(xùn)練，MT與LT組RGCs數(shù)量明顯高于COH組。

表1 各組眼壓比較

圖1 RGCs的NeuN染色

圖2 RGCs計數(shù)

2.2 自噬表達(dá)結(jié)果

Western blot條帶與半定量分析結(jié)果如圖3、圖4所示。COH組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化量明顯升高，其他3組無差異。免疫組化實驗得到的LC3、Beclin1積分光密度值分析結(jié)果如圖5、圖6所示，其中LC3免疫組化與Western blot結(jié)果相符。說明慢性高眼壓造模會提高LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化量并上調(diào)Beclin1表達(dá)，中度與輕度運動會降低LC3轉(zhuǎn)化量與Beclin1表達(dá)量，細(xì)胞自噬水平有所降低。

圖3 LC3條帶

圖4 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化量

圖5 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量

圖6 視網(wǎng)膜LC3、Beclin1染色

2.3 凋亡表達(dá)結(jié)果

TUNEL染色顯示的凋亡RGCs細(xì)胞如圖7所示，COH組凋亡細(xì)胞數(shù)高于另外三組。免疫組化得到的Bax、Bcl-xl積分光密度值分析結(jié)果(圖8、圖9)，Bax蛋白表達(dá)COH組明顯高于CON、MT、LT三組，Bcl-xl蛋白表達(dá)COH組明顯低于CON、MT、LT三組。說明慢性高眼壓造模會上調(diào)Bax表達(dá)并下調(diào)Bcl-xl表達(dá)，中度與輕度運動會降低Bax表達(dá)量并提升Bcl-xl表達(dá)量，細(xì)胞凋亡水平有所降低。

圖7 TUNEL凋亡染色

圖8 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

圖9 視網(wǎng)膜Bcl-xl、Bax染色

3 討論與結(jié)論

本文通過對慢性高眼壓大鼠進(jìn)行中輕度訓(xùn)練，對比研究視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬與凋亡的情況，通過檢測Beclin1、LC3、Bax、Bcl-xl四種蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)中輕度運動會降低LC3轉(zhuǎn)化量與Beclin1、Bax表達(dá)量，提升Bcl-xl表達(dá)量，說明3周的中輕度訓(xùn)練均可以下調(diào)慢性高眼壓造成的RGCs自噬與凋亡水平，兩種運動強(qiáng)度沒有明顯差異，說明中度、輕度訓(xùn)練均有利于修復(fù)慢性高眼壓造成的視網(wǎng)膜損傷。

Beclin1可促進(jìn)自噬體在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的形成，自噬成核階段需要Beclin1[22]。LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，自噬激活時LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ[23]。Beclin1與LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表達(dá)可作為自噬水平的判斷依據(jù)。Bax是典型的促凋亡基因，Bcl-xl是主要表達(dá)在視網(wǎng)膜的抗凋亡基因，二者的變化可反應(yīng)凋亡的分子機(jī)制[24]。本文通過對這四種蛋白的檢測，結(jié)合RGCs染色計數(shù)及凋亡染色，說明了運動可以降低慢性高眼壓動物模型視網(wǎng)膜細(xì)胞的自噬與凋亡水平，進(jìn)而減少RGCs的損失量，對視網(wǎng)膜產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

自噬與凋亡是兩種不同的程序性細(xì)胞死亡機(jī)制。細(xì)胞受到刺激時，一般自噬先于凋亡發(fā)生，自噬的激活在一定程度上可以抑制凋亡的發(fā)生；當(dāng)刺激達(dá)到一定閾值，自噬會誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。因此，運動引起的自噬水平會有升高、降低兩種趨勢。

本文研究表明3周的持續(xù)高眼壓作用下，細(xì)胞自噬產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，運動可以降低細(xì)胞自噬水平，與部分疾病模型[17-18]研究結(jié)果相符；與其他研究中運動提升細(xì)胞自噬水平的結(jié)果[14-16]相異。分析原因，一方面可能是疾病模型與正常模型的區(qū)別，正常模型中運動提升基礎(chǔ)自噬水平產(chǎn)生保護(hù)作用，疾病模型中自噬被過度激活，運動通過下降過度的細(xì)胞自噬產(chǎn)生保護(hù)作用；另一方面可能與運動時間和強(qiáng)度相關(guān)。本文中設(shè)計了兩種運動強(qiáng)度，但產(chǎn)生效果相似，均可以降低細(xì)胞自噬與凋亡的水平，提示MT與LT均屬于適度運動，運動的其他作用仍需要進(jìn)一步細(xì)化運動分級來驗證，比如考慮不同的運動方式[25]。本文就運動影響視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬的表現(xiàn)進(jìn)行了說明，但運動信號如何傳遞至視網(wǎng)膜細(xì)胞引起自噬反應(yīng)，是通過代謝系統(tǒng)還是血液循環(huán)系統(tǒng)等原因仍未可知。此外，關(guān)于細(xì)胞自噬受外界刺激由抗凋亡作用到促凋亡作用轉(zhuǎn)變的臨界點仍不明確，可結(jié)合自噬發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)一步探究。