白藜蘆醇通過抑制炎癥和細胞凋亡預(yù)防脂多糖對小鼠肝臟的損傷

李 川 張 逢,2 陳指龍 楊 青* 袁安文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，長沙410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，長沙410208)

肝臟是機體重要的代謝器官，參與許多生物過程，包括新陳代謝、免疫反應(yīng)、蛋白質(zhì)合成、解毒和抗菌防御等[1]。多種刺激如病原微生物感染、毒素等可誘導(dǎo)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成慢性肝損傷，如不及時治療可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝細胞功能不全甚至肝癌等[2-3]。脂多糖(LPS)又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分。腸道源性細菌內(nèi)毒素是導(dǎo)致多種肝病炎癥的重要機制之一，肝臟中LPS水平的增加會導(dǎo)致肝細胞損傷，刺激肝巨噬細胞釋放許多促炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1、IL-6等，誘導(dǎo)肝臟免疫反應(yīng)，促進肝臟發(fā)生炎癥、細胞發(fā)生凋亡甚至死亡等[4-7]。研究表明許多植物功能成分對肝臟損傷具有很好的保護作用[8-9]。由于植物功能成分具有安全、無應(yīng)激、無殘留等特性，深入研究其抗炎作用效果并了解其作用機制可為肝臟炎癥的防治提供理論基礎(chǔ)。白藜蘆醇(RES)是一種非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等70余種植物或其果實中，其可減輕因許多因素誘導(dǎo)的肝臟損傷[10-11]。李向陽等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在卡介苗和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中，RES可降低小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性及肝臟組織中丙二醛的含量，同時可提高肝臟組織中超氧化物歧化酶的活性和血清中一氧化氮的含量，對肝臟起到較好的保護作用。在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，RES可通過抑制Nod樣受體家族3(NLRP3)炎性體的活化及其下游的炎癥級聯(lián)反應(yīng)減少肝小葉內(nèi)壞死灶、中性粒細胞浸潤及肝細胞的受損面積，從而減輕肝臟的損傷[13]。另外，RES可通過體內(nèi)外抑制凋亡在多種組織和細胞中發(fā)揮其抗凋亡作用。在肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)大鼠模型中，RES聯(lián)合異丙酚抑制肝臟細胞凋亡，對HIRI大鼠肝臟產(chǎn)生了一定的保護作用[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，利用LPS急性暴露可破壞機體中炎癥因子的平衡，誘導(dǎo)全身性的炎癥反應(yīng)[15]，但RES預(yù)處理對LPS單獨誘導(dǎo)的急性肝臟損傷的作用尚不完全明確。本研究利用LPS誘導(dǎo)小鼠急性肝臟損傷，研究不同濃度的RES預(yù)處理對肝臟組織病理學(xué)損傷、相關(guān)細胞凋亡因子及促炎癥細胞因子表達的影響，探討RES對肝臟損傷的預(yù)防效果及其可能的作用機制，以期為肝臟損傷的防治及RES在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及處理

試驗動物為健康的8周齡ICR系雄性小鼠，體重30～35 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分為5組，即對照組、LPS組、RES-L+LPS組、RES-M+LPS組、RES-H+LPS組，每組10只。RES溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，用時根據(jù)小鼠體重稀釋為10(低劑量)、20(中劑量)和40 mg/kg BW(高劑量)3個劑量。RES-L+LPS組、RES-M+LPS組、RES-H+LPS組每天分別灌胃300 μL含10、20和40 mg/kg BW RES的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)灌胃28 d，期間對照組和LPS組灌胃等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。預(yù)處理結(jié)束后，3個RES+LPS組和LPS組腹腔注射200 μL LPS(5.0 mg/kg BW)，該劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[15]確定，對照組腹腔注射等體積生理鹽水，12 h后稱重(20:00注射LPS，第2天08:00采樣)，脫頸處死，收集肝臟并稱重，計算肝臟指數(shù)(肝臟指數(shù)=100×肝臟濕重/小鼠體重)。取所有小鼠肝臟組織，部分用10%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片；部分保存于-80 ℃，用于目的基因 mRNA和目的蛋白表達分析。

1.2.2 HE染色法觀察肝臟組織病理學(xué)

將固定好的肝臟組織用常規(guī)梯度酒精進行脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后切片，厚度為5 μm。將石蠟切片放入二甲苯脫蠟，依次經(jīng)梯度酒精處理至復(fù)水后，分別用HE染液進行染色，脫水，中性樹膠封片，在顯微鏡觀察肝臟組織的病理學(xué)變化。

1.2.3 原位缺口末端標記(TUNEL)法檢測肝臟細胞凋亡情況

根據(jù)試劑盒提供的說明書進行操作，將肝臟組織石蠟切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min，無水乙醇5 min，90%酒精2 min，70%酒精2 min，蒸餾水2 min。用20 μg/mL的蛋白酶K工作液室溫作用20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；在樣品上滴加50 μL預(yù)先配制的TUNEL檢測液，于濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌3次；滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染核，用抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為凋亡信號。利用Image J軟件對熒光信號強度進行分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測肝臟中炎癥因子和凋亡相關(guān)基因的mRNA表達水平

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測肝臟中凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

取少量肝臟組織，加入RIPA細胞裂解液(含1% PMSF)后用勻漿機進行勻漿，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后吸取上清，進行蛋白質(zhì)濃度測定、變性、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離以及轉(zhuǎn)印。待蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上后用0.2%明膠(溶于TBST)室溫封閉1 h；隨后加入一抗(Bax，1∶1 000稀釋；Bcl-2，1∶1 000稀釋；GAPDH，1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜；TBST充分洗滌后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗滌；ECL發(fā)光液進行顯色，于ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)中檢測蛋白質(zhì)條帶并用Image Lab軟件條帶灰度進行分析，目的蛋白以GAPDH為內(nèi)參進行校正。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響如表1所示。低、中、高3個劑量的RES預(yù)處理小鼠28 d后，對小鼠的體重均無顯著影響(P>0.05)；用LPS誘導(dǎo)后，相對于對照組，LPS組和3個RES+LPS組小鼠體重均顯著下降(P>0.05)，但LPS組和3個RES+LPS組間無顯著差異(P>0.05)。同時，LPS誘導(dǎo)后使小鼠肝臟濕重顯著增加(P<0.05)；肝臟指數(shù)結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)可導(dǎo)致小鼠肝臟指數(shù)顯著上升(P<0.05)，而低、中、高3個劑量的RES預(yù)處理均可顯著或極顯著下調(diào)肝臟指數(shù)(P<0.05或P<0.01)，并可達到與對照組差異不顯著的水平(P>0.05)。

2.2 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。對照組小鼠肝臟組織、肝血竇以及中央靜脈無明顯變化，肝細胞輪廓清晰；LPS誘導(dǎo)后，肝臟中央靜脈出現(xiàn)充血，紅細胞堆集等情況，肝細胞發(fā)生腫脹，部分細胞核深染。3個RES預(yù)處理組，中央靜脈隨RES劑量增加其充血減少，肝細胞腫脹也明顯減少，以高劑量RES組效果較好。以上結(jié)果說明RES能夠在一定程度上預(yù)防由LPS誘導(dǎo)所引起的肝臟組織病理損傷。

2.3 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟細胞凋亡的影響

TUNEL凋亡染色如圖2所示。與對照組相比，LPS誘導(dǎo)后可觀察到紅色熒光信號的細胞顯著增多，肝細胞凋亡比例極顯著增加(P<0.01)；RES預(yù)處理作用效果顯示，低劑量的RES對LPS誘導(dǎo)的肝臟細胞凋亡無顯著作用，其肝細胞凋亡比例與LPS組相比無顯著變化(P>0.05)，而中、高劑量的RES均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)所致的肝臟細胞發(fā)生凋亡，其肝細胞凋亡比例與LPS組相比極顯著降低(P<0.01)，且以高劑量的RES預(yù)防作用效果較好。上述結(jié)果說明RES能在一定程度上減少LPS引起的肝臟細胞凋亡。

表1 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

A：對照組 CON group；B：LPS組 LPS group；C：RES-L+LPS組 RES-L+LPS group；D：RES-M+LPS組 RES-M+LPS group；E：RES-H+LPS組 RES-H+LPS group。下圖同 The same as below。

2.4 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟中IL-6和TNF-α mRNA表達的影響

本試驗檢測了肝臟中炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA的表達水平的變化，結(jié)果如圖3所示。LPS誘導(dǎo)后，肝臟中IL-6和TNF-α mRNA的表達水平均極顯著升高(P<0.01)；各劑量RES預(yù)處理組肝臟中IL-6和TNF-α mRNA的表達水平極顯著低于LPS組(P<0.01)，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)。上述結(jié)果說明RES可在一定程度上通過下調(diào)肝臟中部分促炎因子的表達減輕由LPS誘導(dǎo)所致的肝臟炎性損傷。

2.5 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達的影響

本試驗檢測了肝臟中凋亡因子Bcl-2和BaxmRNA和蛋白的表達水平，結(jié)果如圖4所示。LPS誘導(dǎo)可極顯著提高促凋亡基因BaxmRNA的表達水平(P<0.01)，同時極顯著抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達水平(P<0.01)；用RES進行預(yù)處理，LPS對Bax和Bcl-2 mRNA表達的誘導(dǎo)作用受到抑制，3種劑量的RES預(yù)處理均可極顯著提高Bcl-2 mRNA的表達水平(P<0.01)，且可達到與對照組無顯著差異的水平(P>0.05)；3種劑量的RES預(yù)處理可顯著或極顯著降低BaxmRNA的表達水平(P<0.05或P<0.01)，但仍極顯著高于對照組(P<0.01)。LPS對Bax蛋白的作用其mRNA類似，使得Bax蛋白的表達水平極顯著升高(P<0.01)，但Bax蛋白的表達水平受RES的抑制作用更強烈，3種劑量的RES預(yù)處理均使Bax蛋白的表達水平極顯著降低(P<0.01)，且可使其下降到與對照組無顯著差異的水平(P>0.05)；與其對Bcl-2 mRNA的作用相反，LPS誘導(dǎo)使得Bcl-2蛋白的表達水平極顯著上升(P<0.01)，當(dāng)用不同劑量RES預(yù)處理時，對Bcl-2蛋白的表達水平無顯著影響(P>0.05)。

圖a：TUNEL染色肝臟組織。DAPI：肝臟細胞核染色(藍色)；TUNEL：凋亡細胞或血細胞染色(紅色)。標尺大小500 μm。圖b：TUNEL染色陽性細胞的量化和統(tǒng)計分析。

圖3 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟中IL-6和TNF-α mRNA表達的影響

3 討 論

研究表明LPS進入機體會使許多器官產(chǎn)生不同程度的損傷，當(dāng)進入肝細胞時會刺激巨噬細胞釋放大量的炎癥因子，產(chǎn)生細胞毒作用，通過細胞凋亡等多種途徑損傷肝細胞[16-17]。在付凌等[18]利用?；撬峥筁PS誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷研究中，腹腔注射LPS(L18716，10 mg/kg BW)誘導(dǎo)24 h可導(dǎo)致體重下降、肝臟指數(shù)上升并出現(xiàn)明顯的肝臟損傷。本課題組前期研究結(jié)果顯示，腹腔注射較低劑量(5 mg/kg BW)的LPS誘導(dǎo)小鼠12 h后就可導(dǎo)致其體重顯著下降[15]，而在本試驗中進一步發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)后也可顯著增加小鼠的肝臟指數(shù)，誘導(dǎo)所需的劑量和時間較短，這可能與不同來源LPS的毒力不同有關(guān)。肝臟指數(shù)的上升是由于LPS導(dǎo)致促炎因子(如TNF-α、IL-6)水平的上升，肝臟充血，肝細胞腫脹等炎癥的發(fā)生，使肝臟濕重增加，此外，與體重下降也密切相關(guān)。

圖4 RES預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)小鼠肝臟中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達的影響

RES作為一種具有重要活性的多酚類化合物，對多種刺激誘導(dǎo)所致的肝臟損傷具有較好的保護作用。TNF-α是肝衰竭的早期炎癥因子，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞凋亡信號，誘導(dǎo)其他相關(guān)炎癥因子級聯(lián)反應(yīng)，從而加重肝壞死[19]。IL-6是IL家族的核心成員，在B細胞分化、T細胞增殖等方面發(fā)揮著重要的作用，是反映機體炎癥和疾病嚴重程度的指標之一。當(dāng)肝臟中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平升高時，被認為是肝臟損傷的一個標志[20]。夏玉敬等[21]研究發(fā)現(xiàn)，RES對刀豆蛋白誘導(dǎo)引起的急性肝臟損傷有明顯的保護作用，可降低炎癥因子IL-2、IL-6和TNF-α mRNA的表達。周薏等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RES可通過抑制NLRP3炎性體活化及其下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)，顯著減輕四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝臟損傷。本試驗中也發(fā)現(xiàn)RES可在一定程度上預(yù)防LPS誘導(dǎo)所致的肝臟組織病理變化，且高劑量的RES效果較好；RES預(yù)處理可顯著抑制肝臟中促炎因子IL-6和TNF-α mRNA表達水平的上升。

在正常情況下，氧化應(yīng)激可使機體適應(yīng)各種刺激保護細胞免受損傷，多種有害刺激可以打破氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，促使細胞發(fā)生凋亡甚至導(dǎo)致病理損傷。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，在凋亡信號誘導(dǎo)下，胞質(zhì)中的促凋亡蛋白Bax形成Bax-Bax二聚體，破壞線粒體外膜的完整性，使細胞色素C向細胞質(zhì)中釋放，激活半胱天冬酶-3(Caspase-3)導(dǎo)致細胞凋亡[22]。存在于線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2可競爭性的與Bax結(jié)合，形成Bax-Bcl-2二聚體，從而中和Bax的促凋亡作用[23]。本研究通過檢測Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平驗證RES能否抑制LPS對小鼠肝臟細胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)LPS使Bax的mRNA和蛋白表達水平均極顯著升高，不同劑量的RES預(yù)處理均使Bax蛋白的表達水平極顯著降低，且可使其下降到與對照組無顯著差異的水平；而LPS誘導(dǎo)對Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平的影響不一致，LPS誘導(dǎo)使得Bcl-2 mRNA表達水平極顯著降低，而使Bcl-2蛋白的表達水平顯著上升，可能是由于mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯水平不一致所造成的。RES可誘導(dǎo)多種癌細胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮其體內(nèi)外抗腫瘤作用[24]，但對多種因素誘導(dǎo)的正常細胞凋亡具有顯著的抑制作用。孫菁等[25]研究發(fā)現(xiàn)，刀豆素A誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎(AIH)模型中，肝臟組織中出現(xiàn)大量的凋亡細胞，RES預(yù)處理后能夠顯著減少AIH小鼠肝臟的細胞凋亡比例。在肝切除術(shù)的大鼠模型中，RES可降低術(shù)后肝臟損傷，維持肝臟結(jié)構(gòu)，減少細胞凋亡，體外試驗發(fā)現(xiàn)其可能是通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)和降低高遷移率族蛋白1(HMGB1)的乙?；瘉韺崿F(xiàn)的[26]。本研究通過TUNEL原位檢測發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)可導(dǎo)致肝臟細胞凋亡比例增加，而RES預(yù)處理時可顯著抑制細胞發(fā)生凋亡，在一定程度抑制促凋亡基因Bax的表達。目前，RES雖在預(yù)防和治療多種慢性疾病，包括心血管疾病、炎癥性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和皮膚疾病及各種傳染病方面作用效果較好[27]，但闡明其在多種生理條件下的作用機制還需進一步探索。

4 結(jié) 論

RES預(yù)處理可在一定程度上抑制LPS的炎癥誘導(dǎo)作用，通過抑制肝臟中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達降低炎性損傷，并通過抑制肝臟中促凋亡基因Bax的表達減少細胞凋亡，對肝臟損傷起到較好的保護作用。