基于柵藻延遲發(fā)光檢測(cè)的不同產(chǎn)地及炮制方式連翹評(píng)價(jià)方法初探*

荊綺,楊美娜,龐靖祥，閔令圓,韓金祥△

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250062；2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062)

1 引 言

生物光子輻射又稱為超微弱生物發(fā)光(UPE)廣泛存在于各類生物體中，是一種極其微弱的低水平化學(xué)發(fā)光，波長(zhǎng)范圍在 200 ～ 800 nm，對(duì)生物體內(nèi)部的微小變化非常靈敏，與生物體內(nèi)的信息傳遞、光合作用、細(xì)胞分裂等基本生命過(guò)程密切相關(guān)，能夠在一定程度上反映生物體內(nèi)物質(zhì)代謝水平[1-2]。生物超微弱發(fā)光檢測(cè)技術(shù)具有非破壞性、非侵入性、能提供時(shí)空信息等優(yōu)勢(shì)。因此，在醫(yī)學(xué)研究[3-5]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

研究表明，生命物質(zhì)中多模光子輻射與集體生物分子之間的一種相干非線性相互作用是生物光子發(fā)生的主要機(jī)制[1]，表明生物光子輻射強(qiáng)弱是生命體內(nèi)部整體代謝變化的表現(xiàn)，中醫(yī)藥整體性理論與生物光子相性理論存在可通約性，有研究提出可將生物光子相干性理論等現(xiàn)代理論與中醫(yī)藥理論進(jìn)行融合[6-7]?；跂旁逖舆t發(fā)光初步表征中藥寒熱藥性的生物指示劑法是將不同寒熱藥性的中藥煎煮液加入柵藻指示劑中，通過(guò)對(duì)比加入中藥煎煮液前后的柵藻K值來(lái)量化表征中藥藥性[4，8]。該方法靈敏簡(jiǎn)便，可操作性高。本研究以中藥連翹為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用柵藻生物指示劑法，探究分別加入5個(gè)產(chǎn)地、兩種不同炮制方式的中藥連翹煎煮液后柵藻生物指示劑的K值變化，得到K值的主要波動(dòng)范圍，對(duì)不同產(chǎn)地及兩種炮制方式的連翹藥材藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

2.1.1儀器設(shè)備 光照培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、U-3900H紫外分光光度計(jì)、YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x、PM20SP型光電倍增管高壓電源、ACCULAB電子天平、尚朋堂電陶爐、石英比色皿、康舒砂鍋。

2.1.2供試生物 柵藻(Scenedesmus sp．) 自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所采購(gòu)(編號(hào) FACHB-933) ，使用 BG11 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.1.3連翹產(chǎn)地及炮制方式 山西安澤清蒸和生曬各4批次；河南清蒸4批次；河南生曬1批次；山東生曬1批次；陜西商洛清蒸3批次；陜西商洛生曬1批次；河北清蒸1批次。

2.2 方法

2.2.1柵藻培養(yǎng)及濃度測(cè)定 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的柵藻，將其接種于加入BG11 培養(yǎng)基的高壓滅菌的錐形瓶( 500 mL) 中，光照培養(yǎng)箱溫度25℃、光照強(qiáng)度4 000 Lux、光暗比為12∶12 h進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 20 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接比例為1∶5( 藻液: BG11 培養(yǎng)基)，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)[8-9]；柵藻使用前需混勻藻液進(jìn)行濃度測(cè)定，取4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯，加入均勻藻液3 mL，設(shè)定U-3900H紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)為 680 nm測(cè)量藻液的吸光度，控制柵藻吸光度A=2.5，即柵藻細(xì)胞濃度C=3.0×107個(gè)/mL[9]。

2.2.2連翹煎煮液的制備 電子天平精確稱取10 g連翹，量筒量200 mL 水共同置于砂鍋中，浸泡藥材，30 min后，設(shè)置電磁爐功率為2 200 W，時(shí)間15 min，煎煮液劇烈沸騰后，減小加熱功率至800 W，加熱結(jié)束后，使用6層紗布過(guò)濾煎煮液，濾取濾液至250 mL燒杯中；將中藥濾渣再次置于砂鍋中，加入200 mL水，再次使用上述煎煮方法進(jìn)行加熱，加熱結(jié)束后濾取濾液，棄中藥濾渣。將兩次煎煮液混合后置于砂鍋中，設(shè)置電磁爐功率為2 200 W，加熱至煎煮液沸騰后，減小加熱功率至800 W，持續(xù)加熱，直至煎煮液體積濃縮至50 mL,4℃保存24 h后使用[4，9]。

2.2.3中藥煎煮液柵藻指示劑延遲發(fā)光測(cè)量 在石英比色杯中加入2.2.1條件下均勻柵藻溶液3 mL，取100 μL連翹煎煮液上清與藻液混勻，將該石英比色杯置于YPMS-2生物光子測(cè)量?jī)x的暗室內(nèi)，暗適應(yīng)15 min，儀器設(shè)置為：光源白色LED；測(cè)量點(diǎn)900；選擇測(cè)量方法DL；測(cè)量時(shí)間1.000000；光照時(shí)間10 s；重復(fù)次數(shù)7[8-9]，之后進(jìn)行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)處理分析[8-9]

使用軟件statistica10.0處理激發(fā)延遲發(fā)光實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用式(1)進(jìn)行“雙曲”擬合，式(2)計(jì)算延遲發(fā)光平均強(qiáng)度(IW)，將 IW與t進(jìn)行線性擬合，得到相應(yīng)的線性擬合方程。其中斜率K表征了柵藻在不同的液體環(huán)境中延遲發(fā)光的動(dòng)力學(xué)演化行為，可表征樣品性質(zhì)。

I(t)=A×csch2(t/B+C)

(1)

IW=A×B/W×[cothC-coth(W/B+C)]

(2)

其中，A為強(qiáng)度參量，B為特征時(shí)間，C為位相因子，W為總的測(cè)量時(shí)間。

3.2 各個(gè)產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較

將柵藻藻液加入石英比色杯中，在2.2.1條件下，吸取連翹煎煮液加入柵藻中，進(jìn)行激發(fā)延遲發(fā)光的檢測(cè)，再進(jìn)行K值擬合，將全部連翹煎煮液進(jìn)行相同操作，得到各個(gè)產(chǎn)地兩種炮制方式所有批次連翹煎煮液的柵藻K值。首先使用SPSS19.0將相同產(chǎn)地和炮制方式的不同批次連翹的K值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；其次取山西安澤、河南、陜西商洛三個(gè)產(chǎn)地兩種炮制方式的連翹煎煮液，并將同一產(chǎn)地清蒸與生曬的連翹煎煮液K值使用SPSS19.0分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；最后將擬合得到的K值分為清蒸和生曬兩組，對(duì)各組中不同產(chǎn)地連翹煎煮液K值使用SPSS19.0分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3.2.1同一產(chǎn)地及炮制方式不同批次連翹煎煮液柵藻K值比較 對(duì)相同產(chǎn)地及炮制方式的不同批次連翹煎煮液的柵藻K值進(jìn)行對(duì)比分析，見(jiàn)圖1。圖1(a)、(b)分別為山西清蒸連翹及山西生曬連翹不同批次K值測(cè)定；圖1(C)為河南清蒸連翹不同批次K值測(cè)定；圖1(D)為陜西清蒸連翹不同批次K值測(cè)定；圖1(E)為山東生曬連翹不同批次K值測(cè)定。結(jié)果表明，同一產(chǎn)地相同炮制方式的不同批次連翹煎煮液柵藻K值不存在顯著性差異。

圖1 同一產(chǎn)地及炮制方式不同批次連翹K值比較Fig. 1 Comparison of K values of Forsythia suspensa in different batches of the same origins and processing method

3.2.2不同產(chǎn)地及炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較 圖2為相同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值比較，SXAN、HN、SXSL分別代表山西安澤、河南和陜西商洛三個(gè)產(chǎn)地，結(jié)果表明，相同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值之間均存在顯著性差異，且相同產(chǎn)地清蒸連翹煎煮液柵藻K值均高于生曬連翹煎煮液柵藻K值。

圖2 同一產(chǎn)地不同炮制方式K值比較(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)Fig.2 Comparison of K values of different processing methods in the same origin(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

不同產(chǎn)地兩種炮制方式煎煮液柵藻K值比較，見(jiàn)圖3。QZ代表清蒸連翹，SS代表生曬連翹，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地清蒸和生曬連翹煎煮液柵藻K值比較中，產(chǎn)地間均存在顯著性差異。

圖3 不同產(chǎn)地不同炮制方式K值比較(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

3.3 連翹煎煮液柵藻K值波動(dòng)范圍

將不同產(chǎn)地兩種炮制方式所有批次連翹煎煮液柵藻K值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終得到連翹煎煮液柵藻K值波動(dòng)范圍，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地兩種炮制方式連翹煎煮液柵藻K值范圍為0.9806～3.8021，主要波動(dòng)范圍為2.05～2.48。

圖4 連翹K值波動(dòng)范圍Fig.4 Fluctuation range of forsythia K values

4 討論

連翹具有抗菌抗炎、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等作用[10-16]。目前，對(duì)于中藥的研究主要是對(duì)中藥的主要化學(xué)成分及其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究[17-18]，該研究思想主要基于西方醫(yī)學(xué)研究中的還原論，而非基于中藥基礎(chǔ)理論的整體觀念明確中藥對(duì)生物體整體代謝功能的影響[19]。由于生物光子相干性理論與中醫(yī)藥研究中整體論具有相似特征[6]，因此，將中藥藥性通過(guò)對(duì)柵藻激發(fā)延遲發(fā)光數(shù)據(jù)處理得到的K值來(lái)量化表征藥性的方法，符合中醫(yī)整體觀。本研究前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明柵藻K值的正常波動(dòng)范圍為2.81～3.89[9]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入連翹煎煮液后的柵藻K值的主要波動(dòng)范圍為2.05～2.48，明顯低于空白柵藻K值，可能由于連翹藥性為寒性，降低柵藻內(nèi)部代謝反應(yīng)，造成加入連翹煎煮液后的柵藻K值降低，這也與中藥藥性基本理論中的整體觀念相吻合。本研究以柵藻作為生物指示劑對(duì)不同產(chǎn)地及炮制方式的連翹藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，相同產(chǎn)地和炮制方式的不同批次連翹煎煮液柵藻K值不存在顯著性差異；不同產(chǎn)地相同炮制方式連翹煎煮液柵藻K值均存在顯著性差異，且清蒸連翹煎煮液柵藻K值高于生曬連翹煎煮液柵藻K值，考慮可能與連翹清蒸與生曬加工中導(dǎo)致主要化學(xué)成分含量變化有關(guān)。在相同炮制方式不同產(chǎn)地連翹煎煮液柵藻K值比較中，產(chǎn)地之間均存在顯著性差異，考慮可能與生長(zhǎng)環(huán)境不同對(duì)連翹質(zhì)量造成影響。因此本研究中以柵藻作為生物指示劑對(duì)不同產(chǎn)地及炮制方式的同一中藥進(jìn)行評(píng)價(jià)，為中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了更多依據(jù)。但是，柵藻生物指示劑法也僅僅是對(duì)于中藥藥性客觀化表述的初步研究，仍然無(wú)法完全準(zhǔn)確反映中藥寒熱藥性的問(wèn)題。因此，對(duì)于柵藻激發(fā)延遲發(fā)光測(cè)定K值來(lái)表征中藥寒熱藥性，仍需大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)中藥藥材的客觀評(píng)價(jià)方法也需要進(jìn)一步補(bǔ)充和探索。