次生林不同演替時間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

鄭熒楓,李雪,萬曉華,鄒秉章,王思榮,黃志群*

(1.福建師范大學(xué) 地理科學(xué)學(xué)院，福州 350007；2.上杭白砂國有林場，福建 上杭 364205)

0 引言

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的功能組分，調(diào)控著許多生態(tài)學(xué)過程，如土壤有機(jī)質(zhì)分解、土壤碳固存和養(yǎng)分循環(huán)等，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要的角色[1]。植物光合產(chǎn)物和根系分泌物是土壤微生物最重要的碳源，對土壤微生物的繁殖具有重要的作用[2]。反過來，土壤微生物分解過程也調(diào)控著植物所需養(yǎng)分的有效性，從而對樹木的生長產(chǎn)生影響。但是，植被生長過程中，微生物群落生物量和微生物群落組成的變化尚未得到深入研究。

土壤條件的變化，包括土壤水分、土壤養(yǎng)分和pH值均會影響土壤微生物群落[3-7]。土壤微生物群落組成與土壤含水量密切相關(guān)。由于革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌具有更薄的細(xì)胞壁和形成孢子的能力更強(qiáng)，因此，在干燥的條件下革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優(yōu)勢[3]。土壤pH是影響微生物生物量的主要因子，有研究表明當(dāng)pH的范圍在4～8.3之間時，細(xì)菌生物量會隨著pH增高而增加[4,7]。此外，土壤養(yǎng)分有效性也是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因子。Zhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)土壤碳氮比是影響土壤微生物群落的主要因子，隨土壤碳氮比增加，土壤真菌比細(xì)菌值增加。土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)對土壤環(huán)境變化反應(yīng)敏感，而森林植被生長會影響植被組成,使植物豐富度逐漸增加[6]，向土壤中輸入的有機(jī)質(zhì)數(shù)量增加，同時土壤環(huán)境也發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著林齡增加，土壤有機(jī)碳含量持續(xù)增加[3]，pH值降低，含水量增加[8]，進(jìn)而可能會影響微生物群落。但是，國內(nèi)外有關(guān)林齡對微生物群落影響的研究結(jié)果并不一致。Zhao等[9]對喀斯特地區(qū)不同演替階段土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)微生物生物量隨著林齡的增加而增加。但是，也有研究認(rèn)為受中度干擾的影響在中林齡階段土壤微生物生物量最高[10]。有研究發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)的天然次生林可以恢復(fù)退化的土壤特性并保持土壤肥力[11]。但是，隨著次生演替的進(jìn)行，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征如何發(fā)生變化尚不清楚。明確不同演替階段次生林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，有助于認(rèn)識森林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和恢復(fù)力。

假設(shè):(1)隨著次生演替的進(jìn)行，植物豐富度和土壤有機(jī)碳含量增加[5,8]，微生物總量和各類群微生物生物量增加；(2)隨著次生演替的進(jìn)行，pH值降低、土壤含水量和土壤碳氮比增加[7,9]，真菌細(xì)菌比值增加，革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的比值降低。本研究在亞熱帶地區(qū)選取5個(4～5年、8～12年、18～22年、25～30年和35～40年)恢復(fù)階段的天然次生林為研究對象，分析次生林恢復(fù)對土壤微生物生物量和群落組成的變化特征，以及探究影響其變化的主要因素，以期為亞熱帶地區(qū)森林管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省龍巖市上杭縣白砂國有林場(25°04′～25°15′N，116°30′～116°38′E)，屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，海拔為400～800 m，山地坡度為10°～40°，多年平均氣溫為20.1 ℃，多年平均降雨量1 600 mm，無霜期270天左右。主要地貌類型為低山丘陵；土壤主要由花崗巖發(fā)育而成的紅壤組成，主要為黏壤土，土層深厚，立地條件中等。天然次生林優(yōu)勢樹種由早期的杉木(C.lanceolata)過渡到后期的栲樹(Castanopsisfargesii)，木荷(Schimasuperba)等當(dāng)?shù)貎?yōu)勢樹種組成。林下植被主要有狗脊(Woodwardiajaponica)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)、定心藤(Mappianthusiodoides)、毛鱗省藤(Calamusthysanolepis)、短尾越桔(Vacciniumcarlesii)、少葉黃杞(Engelhardtiafenzlii)、油茶(Camelliaoleifera)、黧蒴錐(Castanopsisfissa)等。

1.2 試驗(yàn)地設(shè)置

2018年9月到2019年5月期間，選取4～5年、8～12年、18～22年、25～30年和35～40年的5個演替階段天然次生林為研究對象。4～5年、18～22年、35～40年林分隨機(jī)布設(shè)3個20 m×30 m的真重復(fù)樣地作為試驗(yàn)小區(qū)，8～12年和25～30年林分隨機(jī)布設(shè)4個20 m×30 m的真重復(fù)樣地作為試驗(yàn)小區(qū)。相同林齡段樣地之間的間隔>5 km，距離農(nóng)田、道路或其他類型林地的邊緣大于100 m。所選取的樣地土壤結(jié)構(gòu)一致，前茬樹種均為成熟的天然常綠闊葉林。研究區(qū)土壤基本理化性質(zhì)見表1。

1.3 土壤樣品采集與測定

于2019年8月，在不同演替階段天然次生林的每個試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)，用土鉆(內(nèi)徑為3.5 cm)在各小區(qū)沿著對角線等距離選取10個點(diǎn)，取0～10 cm土層的土壤樣品。同一小區(qū)的土壤樣品均勻混合后裝入自封袋中，放于冰盒內(nèi)保鮮并及時運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在室內(nèi)進(jìn)行土壤樣品前處理。剔除土壤樣品中的碎石以及植物根系等雜質(zhì)，然后過2 mm篩網(wǎng)。將土壤樣品分為兩部分：一部分土樣儲存在-20 ℃冰箱中，用于土壤微生物群落組成的測定；一部分儲存在4 ℃冰箱中，用于土壤含水量、土壤pH、全碳含量等的測定。

土壤容重和含水量用烘干法測定；土壤pH采用土水比為1∶2.5測定；土壤全碳、全氮含量用元素分析儀(Elemental EL MAX CNS analyzer，德國)測定；土壤全磷的測定：用H2SO4-HClO4(4∶1)進(jìn)行高溫消解后，用連續(xù)流動分析儀(Skalar San++，荷蘭)測定。土壤有效磷的測定在風(fēng)干的土樣中加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液，離心過濾后加入0.6 mL濃硫酸酸化，靜置6 h再次過濾，用連續(xù)流動分析儀測定。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的測定用2 mol·L-1的KCl溶液浸提(土水比1∶4)，用連續(xù)流動分析儀測定。

土壤微生物群落組成的測定采用White等[12]的磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)分析法，脂肪酸提取主要過程為在離心管中取新鮮土樣(相當(dāng)于9 g干土重)，加入23 mL磷酸緩沖液、三氯甲烷和甲醇(體積比0.8∶1∶2)的混合液，振動2 h，離心，為保證浸提徹底，此步驟重復(fù)一次。離心后上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗靜置過夜，將下層氯仿相收集并N2吹干。用硅膠柱分別萃取三氯甲烷、丙酮和甲醇的淋洗液，收集最后加入的甲醇相，氮?dú)庀麓蹈桑蝗缓筮M(jìn)行皂化和甲基化，形成脂肪酸甲酯。PLFA含量用nmol·g-1表示。用氣相色譜儀(Agilent 6890N，美國)結(jié)合MIDI微生物識別系統(tǒng)(MIDI，Inc.，Newark，DE)鑒定，異構(gòu)(iso)和前異構(gòu)(anteiso)甲基支鏈脂肪酸(i14∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0、a15∶0、a17∶0)指示革蘭氏陽性細(xì)菌(Gram-positive bacteria，GN)。單一不飽和(monounsaturate-d)和環(huán)丙烷脂肪酸(cyclopropane)指示革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram-negative bacteria，GN；包括16∶1ω9c、16∶1ω7c、18∶1ω7c、18∶1ω5c、cy17∶0、cy19∶0ω8c)。18∶1ω9c和18∶2ω6,9c指示真菌群落(Fungi)，16∶1ω5c指示叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizae fungi，AMF)，10Me16∶0、10Me17∶0、10Me18∶0脂肪酸標(biāo)識放線菌(actino-mycetes，ACT)。PLFA的命名方式中i、a、cy和Me，分別表示異、反異、環(huán)丙基和甲基分枝脂肪酸；ω、c和t分別表示脂肪端、順式空間構(gòu)造和反式空間構(gòu)造。

表 1 不同演替時間次生林土壤基本特征比Table 1 The comparison of soil basic characteristics of secondary forest among different succession time

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和Canoco 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較法檢驗(yàn)不同林齡次生林土壤微生物特性的差異，顯著性(α=0.05)。采用Pearson相關(guān)分析土壤理化性質(zhì)與微生物生物量、真菌生物量、細(xì)菌生物量、革蘭氏陽性菌生物量與革蘭氏陰性菌生物量、放線菌生物量、真細(xì)菌比、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比值之間的關(guān)系。采用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)比較不同林齡次生林間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。采用冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)確定影響土壤微生物群落組成的主要環(huán)境因素。利用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)構(gòu)與分析

2.1 不同林齡土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”， 4～5年、18～22年、35～40年林分的樣本量n=3；8～10年和 25～30年林分的樣本量n=4，不同小寫字母表示不同演替階段次生林之間差異顯著(P<0.05)。圖 1 不同演替時間次生林土壤微生物結(jié)構(gòu)Figure 1 The compositions of soil microbial community in different succession time of secondary forest

圖 2 不同演替時間次生林磷脂脂肪酸的主成分分析 Figure 2 Principal component analysis of PLFAs structures in different succession time of secondary forest

表 2 土壤微生物與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)分析 Table 2 Pearson correlations between microbial and soil physicochemical properties

圖 3 土壤微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)冗余分析 Figure 3 Redundancy analyses for soil microbial community composition based on physicochemical properties

在所有演替階段中，8～12年林分的微生物總量為18.33 nmol·g-1，顯著高于4～5年和18～22年林分(圖1a，P<0.05)。與之相同，真菌生物量在8～12年林分最高，顯著高于4～5年和18～22年林分(圖1b，P<0.05)。森林演替對細(xì)菌生物量、革蘭氏陽性菌生物量和革蘭氏陰性菌生物量均存在明顯影響(圖1c)，且均表現(xiàn)為8～12年林分的生物量顯著高于4～5年和18～22年林分(P<0.05)。但是，森林演替對放線菌的影響不顯著(圖1c，P>0.05)。4～5年林分的革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比值最高，顯著高于8～12年和25～30年林分(圖1d，P<0.05)。并且，4～5年林分的真菌細(xì)菌比最高，顯著高于8～12年林分(圖1e，P<0.05)，與其他演替階段無顯著差異。

不同演替階段次生林的18種磷脂脂肪酸主成分分析表明，各演替階段的微生物群落組成存在顯著差異(圖2)。第1、2主成分對微生物群落結(jié)構(gòu)差異的貢獻(xiàn)值分別為27.66%、23.35%。其中，4～5年林分次生林與25～30年林分次生林存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 土壤微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)與土壤土壤理化性質(zhì)關(guān)系

相關(guān)分析結(jié)果表明(表2)，革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比值與土壤有效磷極顯著正相關(guān)(P< 0.01)。土壤真菌細(xì)菌比與土壤有效磷極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與土壤碳磷比顯著正相關(guān)(P<0.05)。總微生物生物量與全磷顯著正相關(guān)(P<0.05)，與土壤碳氮比極顯著正相關(guān)(P<0.01)。冗余分析結(jié)果顯示，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤碳磷比、pH、銨態(tài)氮、容重以及碳有關(guān)(圖3)。其中，土壤碳磷比和真菌(18∶1ω9c，16∶1ω5c，18∶2ω69c)、放線菌(10Me17∶0，10Me18∶0)正相關(guān)，與革蘭氏陽性菌(i15∶0，a15∶0)和革蘭氏陰性菌(18∶1ω7c，16∶1ω7c，cy17∶0，cy19∶w8c，16∶1ω9c)負(fù)相關(guān)。pH與革蘭氏陰性菌(18∶1ω7c，16∶1ω7c，cy17∶0，cy19∶w8c，16∶1ω9c)與放線菌(10Me17∶0，10Me18∶0)、革蘭氏陽性菌(i14∶0，i16∶0，i17∶0，a17∶0)負(fù)相關(guān)。

3 討論

土壤微生物幾乎參與土壤中所有生態(tài)過程，微生物豐度的大小能反映土壤礦化能力的變化，是評價土壤活性的重要指標(biāo)之一[10]。相關(guān)研究表明，不同發(fā)育階段的林分土壤微生物生物量存在顯著差異。劉順等[16]對不同林齡陳山紅心杉土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，隨著林分林齡的增加，土壤總磷酸脂肪酸含量及各類群微生物磷酸脂肪酸含量均呈現(xiàn)先降低后增加的變化趨勢。這種趨勢產(chǎn)生的原因可能是林分發(fā)育前期，樹木生長需要大量養(yǎng)分導(dǎo)致微生物可利用的養(yǎng)分減少，林分發(fā)育到后期養(yǎng)分周轉(zhuǎn)速率變慢，增加了土壤微生物可利用的養(yǎng)分，從而增加了土壤微生物生物量[17]。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在森林演替過程中土壤總磷酸脂肪酸含量、各類群微生物磷酸脂肪酸含量均呈現(xiàn)增加的趨勢，這與不同演替階段的植被組成有關(guān)。此結(jié)果與本研究不一致。本研究通過磷脂脂肪酸分析方法發(fā)現(xiàn)，磷脂脂肪酸總量、細(xì)菌生物量、真菌生物量、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生物量在8～12年林分最高，且顯著高于4～5年和18～22年林分，與25～30年和35～40年林分間沒有顯著差異。與假設(shè)1不一致。相關(guān)分析結(jié)果顯示，全磷、有效磷含量與總微生物生物量呈正相關(guān)。亞熱帶地區(qū)長期處于磷匱乏狀態(tài)，土壤磷成為限制植物生長的關(guān)鍵因子。在次生林生長發(fā)育過程中，4～5年和18～22年林分土壤磷含量較低，可能不利于植物生長，從而導(dǎo)致土壤微生物的生長和代謝活動下降。因此，土壤磷含量有可能是限制微生物生長的主要因子。

土壤微生物對其生存環(huán)境的變化反應(yīng)敏感，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化反映了微生物與其環(huán)境之間相互作用的變化[18]。Kuramae等[19]對白堊草地各次生演替階段土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同演替階段土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似。本研究結(jié)果表明，4～5年次生林與25～30年次生林微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著性差異，但其他林齡土壤微生物群落結(jié)構(gòu)間均不存在顯著性差異。冗余分析的結(jié)果表明，土壤碳磷比、土壤pH、銨態(tài)氮、土壤容重以及土壤碳是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。但是，這些環(huán)境因子在次生林不同演替時間沒有顯著差異，即林齡對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響并不明顯，僅個別林分土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有差異性。

研究結(jié)果表明，4～5年林分次生林真菌細(xì)菌比和革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌比均高于其他林齡林分。這與假設(shè)2不一致。有研究表明，真菌與細(xì)菌在森林生態(tài)系統(tǒng)有機(jī)質(zhì)分解中具有十分重要的作用，細(xì)菌主導(dǎo)型分解途徑通常在營養(yǎng)豐富(低碳氮比)的土壤占優(yōu)勢地位；而真菌主導(dǎo)型分解途徑通常在低營養(yǎng)(高碳氮比)的土壤中占優(yōu)勢地位[5]。在一定程度上真菌與細(xì)菌比能夠反映出土壤食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能對不同土壤條件的響應(yīng)[20]。相關(guān)研究顯示，不同林分發(fā)育階段土壤真菌細(xì)菌比明顯不同。Jia等[21]發(fā)現(xiàn)在中國半干旱黃土高原廢棄地上的自然演替過程中真菌細(xì)菌比呈增加的趨勢。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是隨著森林的生長發(fā)育，土壤中的難分解有機(jī)質(zhì)增加而易分解有機(jī)質(zhì)減少，真菌相較于細(xì)菌具有更強(qiáng)的腐解能力，善于分解難分解有機(jī)質(zhì)，因此，隨著林齡的增加，真菌生物量在土壤中高于細(xì)菌生物量[22]。但是，Kuramae等[19]對草地上的自然演替研究發(fā)現(xiàn)，隨著自然演替進(jìn)行真菌細(xì)菌比降低。這與本研究相似。在本研究中，真菌細(xì)菌比在4～5年林分次生林中最高。相關(guān)分析結(jié)果顯示，真細(xì)菌比值與土壤碳氮比、土壤有效磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，這表明真菌細(xì)菌比受到土壤碳氮比和有效磷含量影響，在土壤碳氮比和有效磷含量較高的土壤中比值更高。此外，盡管革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌生物量隨著次生林林齡增加的變化趨勢相同。但是4～5年林分革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌比顯著高于8～12年和25～30年林分。有研究認(rèn)為革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌比在森林生長過程中與土壤含水率和土壤質(zhì)量的變化有關(guān)[23]。Zhou等[5]人研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比值與土壤碳氮比呈正相關(guān)，表明革蘭氏陽性菌在高碳氮比土壤中更為普遍，而革蘭氏陰性菌在低碳氮比土壤中占優(yōu)勢。但在本研究中，土壤碳氮比和土壤含水量對革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌比無顯著影響，可能是由于本研究中土壤碳氮比和土壤含水量的變化范圍較小，尤其是土壤碳氮比在不同林齡林分間未達(dá)到顯著差異。在本研究中，革蘭氏陽性細(xì)菌與革蘭氏陰性細(xì)菌比值與有效磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，因此，有效磷含量可能是導(dǎo)致4～5年林分革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比高于其他林分的主要影響因子。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落組成受土壤特性(pH、土壤碳磷比等)的影響。隨著次生林生長，土壤微生物總生物量和各類群微生物生物量的變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為在8～12年林分最高，主要受到土壤磷含量的影響。在次生林演替過程中，土壤特性與微生物群落密切相關(guān)。