乙酰膽堿酯酶基因啟動子區(qū)多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病的關(guān)系

趙 蕾

（北京市石景山醫(yī)院，北京 100043）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer"s disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知受損為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，而乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶。目前大多數(shù)學(xué)者研究表明在AD 患者的腦中AChE 的活性明顯降低，而且下降程度與癡呆的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，特別在患者的大腦皮層和海馬結(jié)構(gòu)中下降尤為明顯。近年來國外對AChE 研究較多，如2010 年，WU 等發(fā)現(xiàn)了AD 患者的膽堿能神經(jīng)元丟失，乙酰膽堿水平下降，乙酰膽堿受體功能障礙［1］。2005 年，RVON 等發(fā)現(xiàn)AD 患者的膽堿能系統(tǒng)受損，血清中AChE 活性明顯下降［2］。國內(nèi)近年亦有相關(guān)研究，2002 年賈建平等研究結(jié)果顯示：AD 患者腦脊液中的乙酰膽堿含量顯著低于對照組并且與簡易智能狀態(tài)量表（MMSE）評分呈正相關(guān)［3］。2020 年陳淑子等研究結(jié)果顯示AD 患者血漿中AChE 活性明顯低于對照組，并且隨著AD 的進(jìn)展，AChE 水平逐漸降低［4］。

有關(guān)AChE 基因的多態(tài)性報道較少，2000 年以前只發(fā)現(xiàn)了5 個有關(guān)人AChE 基因的多態(tài)性位點(diǎn)［5-6］。2004 年，HASIN 等共發(fā)現(xiàn)了13 個AChE 基因的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNPs）［7］。2000 年SHAPIRA 等研究了AChE 基因啟動子上游22 kb 的6 個區(qū)域，只發(fā)現(xiàn)存在2 個鄰近的突變［8］。鑒于AChE 與AD 發(fā)病的密切關(guān)系，我們推測AChE 基因啟動子區(qū)可能也存在著影響AD 發(fā)病的多態(tài)性位點(diǎn)。因此，本研究從AChE基因啟動子區(qū)入手，探討中國漢族人群中AChE基因啟動子區(qū)多態(tài)性與散發(fā)性阿爾茨海默病（Sporadic Alzheimer"s diseases，SAD）發(fā)病的關(guān)系，以期為SAD的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象2000 年—2010 年間首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院門診及住院患者，所有患者均進(jìn)行簡易智能狀態(tài)檢查（MMSE）評分和臨床癡呆評定量表（CDR）。采用1984 年美國國立神經(jīng)病、語言障礙和卒中及阿爾茨海默氏病和相關(guān)疾病協(xié)會（NINCDSADRDA）制定的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，把診斷為“很可能AD”的患者列為SAD 組，患者具備至少1 名神經(jīng)科專家的臨床診斷證明。SAD組共272例，其中男132例，女140 例；平均年齡（70.2±7.5）歲，平均發(fā)病年齡（68.5±5.8）歲。

2000 年—2010 年間宣武醫(yī)院門診體檢者，且均經(jīng)簡易智能狀態(tài)檢查（MMSE）評分和臨床癡呆評定量表（CDR）和門診系統(tǒng)體檢證實(shí)為健康人列為正常對照組。排除嚴(yán)重心、肝、腎及其它全身性系統(tǒng)性疾病者，神經(jīng)或精神系統(tǒng)疾病者，藥物濫用者。正常對照組共278 例，男135 例，女143 例；平均年齡（69.2±8.0）歲。

兩組老年人家族中均無AD 患者，均為中國北方漢族人群。

1.2 AChE 啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)篩查隨機(jī)選取10 例SAD 患者DNA 標(biāo)本和10 例正常對照者DNA標(biāo)本，用標(biāo)準(zhǔn)PCR 方法擴(kuò)增AChE 基因第1 外顯子上游1 196 bp 的近似啟動子區(qū)（位于第1 外顯子上游-1 321 至-125 區(qū)），用直接測序的方法對其進(jìn)行系統(tǒng)篩查（引物序列見表1）。PCR 產(chǎn)物送國家人類基因組北方研究中心測序。

表1 各位點(diǎn)引物序列及分型方法

1.3 多態(tài)性分型對篩查出的多態(tài)性位點(diǎn)用PCR-RFLP 方法、DHPLC 或直接測序的方法進(jìn)行大樣本的多態(tài)性分型（引物序列見表1）。所有標(biāo)本進(jìn)行載脂蛋白E（APOE）分型。

1.4 遺傳學(xué)統(tǒng)計分析用HWE 程序檢測各位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡。等位基因和基因型頻率在SAD 患者和對照者中的分布差別用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件包的卡方檢驗。用Logistic 回歸校正年齡、性別和APOE 等因素的影響。連鎖不平衡分析（D"和r2）、單體型頻率及與疾病的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度在http：//analysis. bio-x. cn/myAnalysis. php 上計算。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AChE 啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的篩查結(jié)果我們隨機(jī)選取10 例SAD 患者和10 例正常對照者，對他們的AChE 近似啟動子區(qū)1 196 bp 片段進(jìn)行直接測序。初步篩查發(fā)現(xiàn)中國漢族人群中存在2個多態(tài)性位點(diǎn)，分別為：rs17883319GC/--和rs3757869A/C。

2.2 多態(tài)性的分型結(jié)果用PCR-RFLP 方法對rs3757869A/C 位點(diǎn)進(jìn)行大樣本分型，PCR 擴(kuò)增的456 bp片段經(jīng)Csp6Ⅰ酶切后，A/A純合型呈292 bp和164 bp兩條帶；A/C雜合型呈456 bp、292 bp和164 bp三條帶；C/C純合型呈456 bp一條帶（圖1）。

對AChE 啟動子區(qū)rs17883319GC/--多態(tài)性擴(kuò)增295 bp 的片段，用DHPLC 方法進(jìn)行分型，GC/--雜合型在色譜圖上呈雙峰；GC/GC 和-/-純合型均呈單峰（圖2）。再將未知純合型與已知純合型按1∶1 配比混合，94 ℃7 min 變性后室溫冷卻復(fù)性30 min，重新用DHPLC方法進(jìn)行分型，若為單峰則其基因型與已知純合型相同，若為雙峰則其基因型與已知純合型相異（表2）。

圖1 rs3757869A/C位點(diǎn)酶切后電泳膠圖

圖2 rs17883319GC/--位點(diǎn)DHPLC分型色譜圖

2.3 遺傳學(xué)統(tǒng)計分析結(jié)果采用HWE 程序檢測，經(jīng)檢驗APOE、rs17883319GC/--和rs3757869A/C 多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布在SAD 組和對照組中均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），說明兩組人群均具有代表性。

對AChE 啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的統(tǒng)計分析得出，rs3757869A/C 和rs17883319GC/--多態(tài)性的等位基因和基因型頻率分布在SAD 組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在進(jìn)行APOE分層分析后得出，在攜帶與不攜帶APOEε4 的亞組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（見表2～3）。采用Logistic 回歸分析校正年齡和性別等因素的影響后仍未發(fā)現(xiàn)這兩個多態(tài)性位點(diǎn)與AD發(fā)病風(fēng)險之間存在關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

表2 rs17883319GC/--多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布/n（%）

表3 rs3757869A/C多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布/n（%）

此外，我們對以上兩個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了連鎖不平衡分析，并未發(fā)現(xiàn)這2 個多態(tài)性位點(diǎn)存在顯著連鎖不平衡（D"=0.515，r2=0.106）。

3 討 論

隨著老齡化社會的迅速發(fā)展，AD 越來越成為嚴(yán)重的社會和家庭問題，但其病因及發(fā)病機(jī)制至今并未完全闡明。目前，AD 的發(fā)病被認(rèn)為是遺傳易感性及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果［9］。多基因缺陷是當(dāng)前AD 有關(guān)遺傳學(xué)研究的共識［10］。目前已證實(shí)4種基因的突變或多態(tài)性與AD 發(fā)病有關(guān)：淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素1（PS1）、早老素2（PS2）和APOE 基因。其中APP、PS1 和PS2 基因與家族性早發(fā)型AD 有關(guān)，位于19 號染色體的APOE 基因的ε4等位基因是目前唯一公認(rèn)的散發(fā)性AD 的風(fēng)險基因，AD 患者攜帶APOEε4 等位基因的頻率是40%［11］。在AD發(fā)病機(jī)制中老年斑中過度沉積Aβ的細(xì)胞毒性作用是AD 發(fā)病的關(guān)鍵因素［12-13］，Aβ 寡聚體又能夠誘導(dǎo)另一個病理改變tau 蛋白過度磷酸化［14］。而近年來研究表明AChE 通過其外周的陰離子位點(diǎn)與老年斑的成分構(gòu)成了穩(wěn)定的復(fù)合物，在AD 患者腦中AChE 的糖基化改變與Aβ 的形成具有緊密的關(guān)聯(lián)［13］，還有研究表明AChE 通過與神經(jīng)纖維形成一種復(fù)合物加速Aβ的聚集［15-16］。

人的AChE 基因定位于7 號染色體長臂7q22上，包含6 個外顯子和5 個內(nèi)含子。2000 年以前只發(fā)現(xiàn)了5 個有關(guān)人AChE 基因的多態(tài)性位點(diǎn)，其中3個在外顯子：H322N、P446P 和P561R［5］；另外2 個在第5 內(nèi)含 子［6］。2004 年，HASIN 等 共 發(fā) 現(xiàn) 了13 個AChE 基因單苷核酸多態(tài)性，它們中有5個可以產(chǎn)生氨基酸取代改變［7］。有關(guān)AChE 基因啟動子區(qū)多態(tài)性的研究較少，2000 年SHAPIRA 等研究了AChE 基因啟動子上游22 kb 的6 個區(qū)域，發(fā)現(xiàn)存在2 個鄰近的突變：一個是T→A 替代，改變了假定的糖皮質(zhì)激素應(yīng)答成分（GRE）的結(jié)合位點(diǎn)；另一個是4 個堿基的缺失，缺失了1 個或2 個鄰近的肝細(xì)胞核因子3（HNF3）結(jié)合單位，并且在缺失突變和ACHE 編碼區(qū)的H322N 突變之間存在連鎖不平衡關(guān)系［8］。鑒于AChE與AD發(fā)病的密切關(guān)系，我們推測AChE基因啟動子區(qū)可能也存在著影響AD發(fā)病的多態(tài)性位點(diǎn)。

我們研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群的AChE 基因啟動子區(qū)存在兩個多態(tài)性位點(diǎn)：rs17883319GC/--和rs3757869A/C。經(jīng)遺傳統(tǒng)計學(xué)分析，得出這兩個多態(tài)性的等位基因和基因型頻率在SAD 組和對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），采用APOE分層分析、Logistic 回歸分析及連鎖不平衡分析后仍未發(fā)現(xiàn)此基因啟動子區(qū)多態(tài)性與SAD 發(fā)病風(fēng)險之間存在關(guān)聯(lián)。2007年P(guān)ICCARDI M 等對撒丁島人樣本進(jìn)行過類似研究，他們對158 例AD 患者和118 例健康對照進(jìn)行了AChE 基因多態(tài)性與AD 發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究，結(jié)果顯示AChE 基因多態(tài)性的等位基因和基因型頻率在AD 組和對照組之間無顯著差異，單體型分析后仍未發(fā)現(xiàn)此基因多態(tài)性與AD 發(fā)病風(fēng)險之間存在關(guān)聯(lián)［17］。

我們的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)AChE 基因啟動子區(qū)多態(tài)性與SAD 發(fā)病相關(guān)，提示該基因啟動子區(qū)多態(tài)性與SAD 發(fā)病的關(guān)系可能并不十分密切，AD 是多基因遺傳疾病，AChE 基因可能不是引起AD 發(fā)病的主要基因；其他非編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的篩查及功能有待進(jìn)一步的研究，此結(jié)論尚需在更大規(guī)模的人群中進(jìn)行證實(shí)，這將有助于為AD 的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)并進(jìn)一步指導(dǎo)AD的臨床治療。