不同肩袖肌腱損傷動物模型建立與評價

[摘要] 目的 應用兔肩胛下肌肌腱建立肩袖肌腱不同損傷自然愈合模型，并進行生物力學、組織學評價。

方法 將18只4周齡兔隨機分為部分組、新月組和L型組，分別建立左側(cè)肩胛下肌部分損傷、新月型損傷和L型損傷模型，右側(cè)實施假手術作為對照側(cè)。術后4個月采用蘇木精-伊紅（HE）、Masson染色觀察肌腱愈合情況，采用強力儀檢測肌腱生物力學強度。

結(jié)果 兔肩胛下肌不同損傷模型建立成功，HE、Masson染色可見各組損傷部位被瘢痕組織填充。生物力學強度測試顯示，部分組、L型組與新月組比較，實驗側(cè)/對照側(cè)最大負荷百分比、實驗側(cè)/對照側(cè)楊氏模量百分比差異有統(tǒng)計學意義（F=36.292、18.876，P<0.05）。

結(jié)論 不同肩袖損傷方式對肩袖自然愈合可產(chǎn)生不同影響，新月型損傷愈合較部分損傷及L型損傷更好。

[關鍵詞] 回旋套損傷;腱;模型，動物;兔

[中圖分類號] R684.7

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0703-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.142

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1546.004.html;2021-07-07 10：29：40

ESTABLISHMENT OF ANIMAL MODELS OF DIFFERENT ROTATOR CUFF TENDON INJURIES AND THEIR EVALUATIONS

YU Chenghao， WANG Lei， PENG Haining， ZHANG Yi， YU Tengbo

（Department of Sports Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT] Objective To establish natural healing models of different rotator cuff tendon injuries using the subscapularis tendons of rabbits， and to perform biomechanical and histological evaluations.

Methods Eighteen 4-week-old rabbits were randomly divided into partial group， crescent group， and L-shaped group， in which partial injury， crescent injury， and L-shaped injury were made in the subscapularis muscle on the left side， while sham procedures were performed on the right side as controls. At 4 months after operation， hematoxylin-eosin （HE） staining and Masson staining were performed to observe the tendon healing; the biomechanical strength of the tendons was measured by a strength analyzer.

Results Different subscapularis injury models were established successfully. HE and Masson staining showed scar tissue filling in the injured parts in each group. The biological strength testing showed that the partial group and the L-shaped group had significant differences in the percentages of maximum load and Young’s modulus on the experimental side/control side as compared with the crescent group （F=36.292，18.876;Plt;0.05）.

Conclusion

Different types of rotator cuff injuries have different effects on the natural healing of rotator cuffs， and crescent injuries heal better than partial injuries and L-shaped injuries.

[KEY WORDS] rotator cuff injuries; tendons; models， animal; rabbits

肩袖撕裂是肩袖及其鄰近軟組織損傷的總稱，可以導致肩的疼痛和功能障礙。肩袖由岡上肌、岡下肌、肩胛下肌和小圓肌的肌腱以及肩關節(jié)囊等組成，對限制肩關節(jié)的過度活動和維持功能穩(wěn)定性具有重要作用。肩袖撕裂在肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中占有很大的比例。在美國每年超過25萬人因為肩袖損傷接受了手術治療，并且肩袖損傷的發(fā)生率逐年增加[1-2]。肩袖撕裂的類型往往不同，根據(jù)Ellman分型可將肩袖撕裂分為新月型撕裂、L型撕裂、反L型撕裂、梯形撕裂和巨大型撕裂[3]。不同的撕裂類型可導致不同的臨床表現(xiàn)。

目前，有多種動物可以被用作比較與評價不同類型肩袖損傷愈合狀況的模型動物，例如大鼠[4]、兔[5-6]、狗[7-8]、小牛[9]和綿羊[10-12]等。研究表明，雖然大鼠岡上肌在向前運動過程中會穿過纖維骨隧道，但是，穿過該隧道的是肌肉而不是肌腱[13]。此外，大鼠的岡上肌太小，造模困難。兔體型居中，價格低廉，易于飼養(yǎng)，目前兔肩袖已有多處肌腱用于肩袖損傷模型的建立，包括岡上肌[14-15]、岡下肌[16]以及肩胛下肌[17]。

其中兔肩胛下肌肌腱與人岡上肌肌腱的位置與解剖結(jié)構(gòu)相似，大小尚可，適合制備肩袖損傷模型進行研究[18]。故本研究以兔為模型動物，建立肩胛下肌的部分損傷、L型損傷和新月型損傷模型，通過生物力學與組織學評價，分析不同撕裂類型對肩袖損傷自然愈合的影響，以探尋適合今后實驗的肩袖損傷模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用18只體質(zhì)量2.0～3.0 kg的成年雄性新西蘭大白兔由青島大學動物實驗中心提供;美國Instron-3300萬能材料試驗機由青島大學提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 將18只大白兔隨機分為部分組、L型組和新月組，每組6只。以大白兔左側(cè)肩胛下肌為實驗側(cè)，右側(cè)肩胛下肌為對照側(cè)。應用100 g/L水合氯醛（2.5 mL/kg）行腹腔注射麻醉，待兔角膜反射及夾捏反應消失后，將兔固定于手術臺上，進行備皮、碘附消毒，鋪無菌洞巾。于肩關節(jié)部位注射20 g/L利多卡因2 mL進行局部麻醉。于肩關節(jié)外側(cè)做一長約3 cm縱形切口，分離三角肌及岡上肌，顯露肩胛下肌。測量兔肩胛下肌肌腱在肱骨小結(jié)節(jié)止點寬度;部分組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處滑囊側(cè)切斷約50%;L型組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處一側(cè)切斷約50%;新月組將肩胛下肌肌腱于小結(jié)節(jié)連接處中間部分切斷約50%（圖1）。逐層縫合，關閉切口，覆蓋紗布。對照側(cè)進行假手術，顯露肩胛下肌肌腱后關閉切口。術后給予青霉素4×105 U后肢肌注預防感染，持續(xù)3 d;允許兔籠內(nèi)自由活動，未見活動障礙。

1.2.2 組織學觀察 術后4個月，從3組中各取1只兔，以左側(cè)肩胛下肌損傷處為中心，截取肩胛下肌肌腱損傷處組織，用于觀察肌腱愈合情況。標本經(jīng)冷凍、包埋后切成6 μm厚的連續(xù)切片。分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色，在光鏡下觀察肩胛下肌肌腱損傷后愈合的組織學變化。

1.2.3 生物力學測試 術后4個月，從3組中各取5只兔，以肩胛下肌止點為中心，截取整塊肩胛下肌及近端肱骨（雙側(cè)全部截取），處理肩胛下肌肌肉，留肌腱與近端肱骨，進行生物力學測試。肌腱側(cè)采用“三明治”（砂紙-萬能膠-肌腱-萬能膠-砂紙）方法固定，近端肱骨采用麻繩固定。調(diào)整合適后，在美國Instron-3300萬能材料試驗機上進行拉力測試，載荷率為0.4 mm/s，詳細觀察記錄肩胛下肌肌腱被拉斷時的斷裂部位、最大載荷（N）及楊氏模量（MPa）。為消除個體間的差異，以肩胛下肌實驗側(cè)/對照側(cè)最大載荷及實驗側(cè)/對照側(cè)楊氏模量的百分比作為生物力學強度指標。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組整體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差異t檢驗（LSD法）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)" 果

2.1 組織學觀察

2.1.1 大體觀察 肌腱損傷處可清晰辨認，部分可見結(jié)節(jié)形成，肌肉周圍出現(xiàn)脂肪浸潤，未見明顯肌肉萎縮（圖2a～c）。

2.1.2 染色觀察 部分組實驗側(cè)HE染色可見損傷處被致密結(jié)締組織填充，與周圍正常肌腱組織分界清晰;Masson染色可見損傷處結(jié)締組織排列紊亂，膠原含量較正常肌腱組織少（圖2d、g）。新月組實驗側(cè)HE染色可見損傷處組織較正常肌腱組織疏松，走行不規(guī)則;Masson染色可見損傷處膠原含量與周圍正常組織接近，但組織更為疏松（圖2e、h）。L型組實驗側(cè)HE染色可見致密結(jié)締組織堆積，與周圍正常組織分界清晰;Masson染色可見損傷處結(jié)締組織排列不規(guī)則，膠原含量較周圍正常肌腱組織少（圖2f、i）。

2.2 生物力學測試

在生物力學拉伸測試中，3組標本在承受最大負荷時的撕裂部位均為手術損傷處。3組肩胛下肌實驗側(cè)/對照側(cè)最大載荷及實驗側(cè)/對照側(cè)楊氏模量的百分比相比較，差異均具有顯著性（F=36.292、18.876，P<0.05）。組間兩兩比較，部分組和L型組肩胛下肌實驗側(cè)/對照側(cè)最大載荷百分比均顯著低于新月組（t=8.023、6.494，P<0.05），而部分組與L型組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.529，P>0.05）;同樣，部分組和L型組肩胛下肌的實驗側(cè)/對照側(cè)最大楊氏模量百分比均顯著低于新月組（t=5.781、4.963，P<0.05），而部分組與L型組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.088，P>0.05）。見表1。

3 討" 論

兔肩胛下肌已被證明具有與人類岡上肌相似的解剖學和生物力學特性[19]。同時，兔的體型中等，價格低廉，飼養(yǎng)方便，具有進行動物實驗的天然優(yōu)勢。不同的是，人肩關節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)復雜和活動范圍大，肩袖肌腱的血運少，因此人的肩袖撕裂一般很難愈合[20]。本研究以兔為模型動物，建立了兔肩胛下肌肌腱損傷的3種動物模型（部分、新月、L型），并使其自然愈合，探討不同的損傷類型對肩袖損傷自然愈合的影響。

肌腱細胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型膠原和糖蛋白組成。Ⅰ型膠原約占所有膠原蛋白的95%，占肌腱干質(zhì)量的65%～80%[21]。其他類型膠原蛋白的含量雖然較低，但也起著重要作用。肌腱損傷后，損傷部位發(fā)生炎癥反應，巨噬細胞可清除并稀釋有害物質(zhì)，防止損傷的進一步發(fā)展，新生血管形成為運輸修復所需的大量氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)以及凝血因子等提供了結(jié)構(gòu)基礎。在正常的組織愈合過程中，炎癥反應誘導巨噬細胞進入損傷部位，消化并清除凝塊，提供生長因子，且成纖維細胞逐漸增多，血管增多，氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)的輸送得到滿足;在肌腱重塑過程中，肉芽組織逐漸被新合成的膠原所替代，成纖維細胞進入凋亡程序，最終形成細胞密度較低的瘢痕組織。Ⅲ型膠原的合成在早期的修復過程中會有所增加，但隨著新的Ⅰ型膠原的合成并參與組織修復過程，Ⅲ型膠原會逐漸減少[22]。

本研究中，損傷后愈合部位的組織主要為致密的瘢痕組織，且其抗拉能力較正常肌腱組織弱。這一結(jié)果與BUTLER等[23]的研究報道相同。一項涉及綿羊模型跟腱橫斷和部分切除的研究結(jié)果表明，傷口部位似乎可在沒有術后固定的情況下自動愈合，并在12個月內(nèi)獲得了足夠的穩(wěn)定性，而不需要手術重新建立組織連接[24]。所有的綿羊在至少6周后都恢復了部分負重能力，并且在至少8周后沒有表現(xiàn)出跛行或步態(tài)限制，然而與正常組織相比，傷口部位仍然較弱（承受最大載荷較低）。另一項兔臏腱損傷模型實驗研究結(jié)果顯示，在造成髕腱缺損損傷僅1.5個月后，修復組織就達到了正常組織最大載荷的7%～9%，然而，到損傷后3個月和6個月時，修復組織最大載荷分別僅為正常組織的11%和8%[25]。本研究結(jié)果表明，不同肌腱損傷所致的肩袖損傷自然愈合結(jié)果是不同的。部分損傷和L型損傷后，肩胛下肌實驗側(cè)/對照側(cè)最大載荷百分比均低于新月型損傷，3組間楊氏模量比較也得到相同的結(jié)果。其主要原因是肩袖損傷類型的不同，不同的損傷類型可導致肌腱下肌不同程度的收縮，損傷處分離，出現(xiàn)缺口，進而導致結(jié)締組織浸潤的范圍不同。其中以L型損傷收縮最為明顯，因此結(jié)締組織填充較多，愈合后承受負荷的能力較弱。新月型損傷愈合良好的原因可能是，兩邊的肌腱組織為結(jié)締組織的浸潤填充起到了框架的作用，肩胛下肌收縮較少。損傷愈合較差的次要原因是脂肪浸潤，脂肪浸潤是肩袖撕裂中肩袖肌肉的主要退行性改變之一，且已被證明對肌腱修復愈合的結(jié)果有負面影響[26]。脂肪浸潤的一個可能原因是肌腱損傷后肌肉萎縮，牽拉神經(jīng)，使神經(jīng)肌軸受損，繼而出現(xiàn)脂肪細胞堆積浸潤[6]。本實驗缺陷為樣本量小且未對脂肪浸潤進行定量檢測;另外，與人不同的是，兔肩關節(jié)基本不進行外展活動，而人的肩關節(jié)損傷后有可能活動范圍增大而導致進一步損傷。

綜上所述，本研究建立了不同類型兔肩袖損傷模型，并進行了生物力學與組織學評價，結(jié)果表明不同損傷類型對肩袖損傷自然愈合的影響不同，新月型損傷愈合較部分損傷及L型損傷更好。在接下來的實驗中，可建立不同時間的不同類型的肩袖損傷模型，探究損傷類型對肌腱脂肪浸潤的影響;或是建立不同損傷類型模型后，給予相同的修復處理，觀察不同損傷類型對修復效果的影響。

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（本文編輯 馬偉平）