Anle138b對慢性AβOs誘導海馬神經元毒性作用影響

[摘要] 目的 觀察二苯基吡唑化合物Anle138b對β淀粉樣蛋白寡聚體（AβOs）誘導的海馬神經元毒性作用的影響。

方法 原代培養(yǎng)的海馬神經元細胞成熟后，將其分為空白對照組、AβOs處理組（用0.1 μmol/L AβOs處理7 d）和Anle138b處理組（用0.1 μmol/L AβOs處理7 d，在AβOs處理的后2 d加用0.1 μmol/L Anle138b）。使用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測細胞損傷情況，采用蛋白質免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達。

結果 與空白對照組相比較，AβOs處理組海馬神經元細胞LDH釋放量增加（F=14.810，q=7.481，Plt;0.01），凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達升高（F=6.677，q=4.816，Plt;0.05）。與AβOs處理組相比，Anle138b處理組海馬神經元細胞LDH釋放量降低（q=5.310，Plt;0.05），凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。

結論 Anle138b在慢性AβOs誘導的海馬神經元凋亡模型中具有一定的保護作用。

[關鍵詞] 阿爾茨海默病;蛋白質聚集體;淀粉樣β肽類;Anle138b;海馬;神經元;毒性作用

[中圖分類號] R338.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0662-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.185

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.1333.003.html;2021-11-02 14：23：02

EFFECT OF ANLE138B ON CHRONIC HIPPOCAMPAL NEURONAL TOXICITY INDUCED BY β-AMYLOID PEPTIDE OLIGOMERS

LIU Wei

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medical， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the diphenyl-pyrazole compound Anle138b on hippocampal neuronal toxicity induced by β-amyloid peptide oligomers （AβOs）.

Methods After the primary cultured hippocampal neurons became mature， they were divided into blank control group， AβOs treatment group （treated with 0.1 μmol/L AβOs for 7 days）， and Anle138b treatment group （treated with 0.1 μmol/L AβOs 5 days and then treated with both AβOs and 0.1 μmol/L Anle138b for 2 days）. Lactate dehydrogenase （LDH） kit was used to observe cell damage， and Western blot was used to measure the expression of the apoptosis protein cleaved caspase-3.

Results Compared with the blank control group， the AβOs treatment group had significant increases in the release of LDH in hippocampal neurons （F=14.810，q=7.481，Plt;0.01） and the expression of the apoptotic protein cleaved caspase-3 （F=6.677，q=4.816，Plt;0.05）. Compared with the AβOs treatment group， the Anle138b treatment group had a significant reduction in the release of LDH in hippocampal neurons （q=5.310，Plt;0.05）， as well as a tendency of reduction in the expression of the apoptotic protein cleaved caspase-3， but with no significant difference （Pgt;0.05）.

Conclusion

Anle138b has a certain protective effect in the model of chronic hippocampal neuronal apoptosis induced by AβOs.

[KEY WORDS] Alzheimer disease; protein aggregates; amyloid beta-peptides; Anle138b; hippocampus; neurons; toxic actions

阿爾茨海默病（AD）又稱為老年癡呆癥，是一種多發(fā)于老年人群的神經退行性疾病，也是癡呆癥最常見的病因。隨著預期壽命的持續(xù)增長，AD發(fā)病率將會越來越高。到2050年，全世界癡呆癥的人數預計將增加到1.315億[1]。盡管進行了數十年的研究，但該病至今尚未找到有效的治療方法。AD的病因復雜，涉及遺傳、環(huán)境等多種因素。目前關于AD病因的假說有很多，包括膽堿能假說、β淀粉樣蛋白（Aβ）毒性假說、tau蛋白異常修飾假說、鈣穩(wěn)態(tài)假說等，其中被廣泛認同的是Aβ毒性假說[2-3]。離子通道假說是Aβ發(fā)揮毒性的一種機制，該假說認為，Aβ變構、組裝成離子通道結構，嵌入脂質雙層膜，造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡，進而導致神經元的損傷和死亡[4-5]。

Anle138b是一種低聚物調節(jié)劑，具有出色的口服生物利用度和血-腦脊液屏障滲透性，并且在治療劑量下沒有可檢測到的毒性[6]。分子動力學模擬實驗表明，Anle138b可以有效地阻斷肽鏈相互作用并阻止自發(fā)形成有序的β-折疊結構[7]。2018年，MAR-TINEZ HERNANDEZ等[8]對AD大鼠模型及人工膜的研究表明，Anle138b可以阻止Aβ打孔的活動，而不會改變膜嵌入的Aβ低聚物結構。Anle138b是首個被報道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物，并且還可以減少病理性tau蛋白聚集體，是治療AD相關病理改變的新型且有希望的化合物，但是該藥在細胞模型上的研究結果較少[9]。因此，本實驗在細胞模型上通過對海馬神經元凋亡損傷情況的檢測，觀察了Aβ通道抑制劑Anle138b對慢性Aβ寡聚體（AβOs）誘導的海馬神經元毒性作用的影響，為開發(fā)治療AD新型藥物提供思路?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

原代培養(yǎng)的海馬神經元細胞（從大鼠新生鼠腦內獲?。?，DMEM/F12基礎培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Hyclone公司），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），Anle138b（Medchem Express公司），青霉素-鏈霉素溶液（100×，北京索萊寶科技有限公司），Aβ42單體粉末（杭州丹港生物科技有限公司），BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），D-多聚賴氨酸（美國Sigma公司），cleaved caspase-3抗體（上海Cell Signaling公司），ECL發(fā)光液以及PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 AβOs制備 取1 mg的Aβ42粉末和六氟異丙醇（HFIP）置于冰上預冷，向裝有Aβ42粉末的EP管中加入222 μL的HFIP，密封，渦旋混勻，室溫下孵育60 min，直到液體澄清，得到1 mmol/L的 Aβ-HFIP溶液。將Aβ-HFIP溶液置于冰上5 min，取4只無菌EP管，分裝Aβ-HFIP溶液55 μL，在通風櫥中將HFIP揮干，得到無色透明Aβ肽膜，置-20 ℃冰箱保存。使用前，取1支分裝管，在冰上加入二甲基亞砜（DMSO）11 μL，水浴超聲（300 W，35 Hz）處理10 min，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）539 μL，渦旋混勻，置于冰箱中4 ℃孵育1 d。使用離心機在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，上清即為100 μmol/L的AβOs[10]。

1.2.2 海馬神經元細胞培養(yǎng) 實驗前先將所有實驗器械高壓滅菌以確保細胞不被污染。12孔板用多聚賴氨酸包被，在細胞培養(yǎng)箱中放置2 h以上，實驗前用高壓后的雙蒸水沖洗3次，去除多聚賴氨酸，放于培養(yǎng)箱中備用。將小鼠浸泡于體積分數0.75的乙醇中消毒，用剪刀剪下頭部后取出大腦，將其置于盛有基礎培養(yǎng)液預冷的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下取出海馬體（位于大腦皮質內，有較為明顯的血管膜界限），并去除血管膜。加入胰蛋白酶5 mL，在細胞培養(yǎng)箱中消化5 min，使用含有FBS的完全培養(yǎng)液終止消化。使用移液槍將海馬體移至新的培養(yǎng)皿中，將其吹打均勻，沉淀后轉移上清至離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含B27的培養(yǎng)液輕輕吹打混勻。用細胞計數板進行細胞計數，調整細胞密度約為7×108/L。將細胞懸液以每孔1.5 mL接種于6孔板中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d進行1次半換液，細胞培養(yǎng)7～8 d后觀察細胞狀態(tài)，待神經元胞體發(fā)育飽滿、突觸連接明顯后用于后續(xù)實驗。

1.2.3 實驗分組及處理 實驗分為空白對照組（A組，無處理措施）、AβOs處理組（B組，用0.1 μmol/L的AβOs處理7 d）和Anle138b處理組（C組，用0.1 μmol/L的AβOs處理7 d，在AβOs處理后5 d加用0.1 μmol/L的Anle138b）。

1.2.4 海馬神經元LDH釋放量檢測 細胞處理結束后，轉移各組上清至EP管中，并置于冰上。按照試劑盒說明書進行LDH檢測，操作過程應謹慎迅速，防止LDH降解。將待測樣本轉移到96孔板中，加入基質緩沖液和輔酶Ⅰ后，37 ℃孵育15 min;加入2，4-二硝基苯肼，37 ℃孵育15 min;加入NaOH溶液，室溫孵育5 min;用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值，按照試劑盒說明書的公式計算培養(yǎng)液中LDH含量。

1.2.5 蛋白質免疫印跡（Western blot）方法檢測cleaved caspase-3的表達 將待測樣本轉移到12孔板中，每孔加入蛋白裂解液60 μL，在冰上裂解30 min，使用刮板將貼附在板底的海馬神經元細胞刮凈，轉移裂解液和細胞至EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取上清至新的EP管中，使用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度。加入1/4上清量的5×Loading Buffer，95 ℃加熱5 min，樣品置于-20 ℃保存。使用125 g/L的PAGE凝膠進行電泳，將制備好的蛋白樣品加入膠孔中，以80 V電壓跑濃縮膠，120 V電壓跑分離膠。電泳結束后，取出凝膠，應用0.22 μm的PVDF膜進行轉膜，以300 mA恒定電流在冰上轉膜約90 min。轉膜結束后，用封閉液封閉 2 h，根據分子量大小裁膜，得到相關蛋白條帶后加入一抗（稀釋比例1∶800），4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗3次，每次10 min;加入二抗（稀釋比例1∶10 000）后室溫孵育 1 h，TBST洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影后，用Image J軟件進行灰度分析，結果以目的蛋白與內參照蛋白β-actin的灰度值之比表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結果以±s的形式表示，多組數據比較采用單因素方差分析，并繼以Tukey法進行多重比較。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結" 果

2.1 Anle138b對AβOs誘導細胞凋亡模型LDH釋放量的影響

與空白對照組相比，AβOs處理組海馬神經元細胞LDH釋放量增加（F=14.810，q=7.481，Plt;0.01）;與AβOs處理組相比較，Anle138b處理組海馬神經元細胞的LDH釋放量降低（q=5.310，Plt;0.05）。見表1。

2.2 Anle138b對AβOs誘導細胞凋亡模型cleaved caspase-3蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與空白對照組相比，AβOs 處理組細胞凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達升高（F=6.677，q=4.816，Plt;0.05）;與AβOs處理組相比較，Anle138b處理組海馬神經元細胞cleaved caspase-3蛋白的表達有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（q=3.255，Pgt;0.05）。見表1。

3 討" 論

隨著社會老齡化的加劇，在中老年人群中AD患病率成倍增加，給社會和家庭帶來沉重負擔。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療AD藥物主要有兩類，一類是膽堿酯酶抑制劑，另一類是興奮性氨基酸受體拮抗劑[11]。盡管已證明這些藥物對AD癥狀的控制具有統(tǒng)計學意義，但它們的治療效果并不穩(wěn)定，并且作用持續(xù)時間有限[12]?；诂F有療法的低效率，迫切需要開發(fā)能阻止疾病發(fā)展的藥劑，找到AD的新療法。而Aβ通道小分子阻斷劑將會是治療AD相關病理改變的一種新穎且有希望的化合物[9]。Anle138b是首個被報道的能夠在通道形成后將其阻斷并改善Aβ病理變化的化合物，但是該藥物在細胞模型上的研究結果較少，因此本實驗使用體外培養(yǎng)的原代海馬神經元作為實驗材料，并且降低AβOs給藥濃度，采用連續(xù)7 d慢性給藥的方式，研究Anle138b對慢性AβOs誘導的海馬神經元毒性作用的影響。相較于人工膜以及急性分離模型，原代培養(yǎng)的海馬神經元可以形成較為發(fā)達的神經網絡，細胞間可以進行突觸傳遞和信號交流，更加接近生理環(huán)境。本實驗先給予AβOs處理5 d，再用Anle138b和AβOs共處理2 d，這種給藥方式更能表現出Anle138b能夠在Aβ通道形成后將其阻斷的作用機制，這也是本實驗設計的創(chuàng)新性所在。

本文的實驗結果顯示，與AβOs處理組相比，Anle138b處理能夠降低海馬神經元細胞LDH釋放量，并且凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達也呈下降趨勢。表明Anle138b在慢性AβOs誘導的海馬神經元凋亡模型中有一定的保護作用。后續(xù)研究尚需進一步加大樣本量，這樣cleaved caspase-3蛋白表達量的下降將可能有統(tǒng)計學意義，實驗結果會更明確且具有說服力。近年來，Aβ如何影響神經元和突觸功能受到關注[13-15]。而Aβ與質膜的相互作用是AD發(fā)展的關鍵，二者相互作用的結果之一就是形成離子通道[16-18]。離子通道形成后，會造成膜泄漏和鈣穩(wěn)態(tài)失衡進而導致神經元的損傷和死亡[19]。本研究Anle138b表現出對海馬神經元的保護作用可能就是通過阻斷Aβ通道的作用。到目前為止，在包括輕度至中度AD病人的臨床試驗中，大部分治療方法均未成功通過Ⅲ期臨床試驗，進行分析時，在疾病過程中采取干預措施開始太晚是解釋此類失敗的經常性的論據之一，認為早期的預防性治療將帶來好處[20]。aducanumab抗體的臨床試驗也是集中在早期或中期病人[21-23]，然而實際上AD病人被確診基本處于發(fā)病后期，并且目前AD發(fā)病早期的診斷尚不成熟[24]。因此，尋求一種能在AD發(fā)病后期發(fā)揮重要作用的藥物非常重要。而在本實驗中，Anle138b加藥時間是在AβOs處理一定時間之后，故像Anle138b這種小分子阻斷劑可能在該病的治療中有很大的潛力[25]。

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（本文編輯 馬偉平）