側(cè)腦室注射α-突觸核蛋白對黑質(zhì)和紋狀體單胺氧化酶B表達的影響

[摘要] 目的 探討側(cè)腦室注射α-突觸核蛋白（α-syn）對小鼠黑質(zhì)和紋狀體區(qū)單胺氧化酶B（MAO-B）蛋白表達以及運動功能的影響。

方法 將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為生理鹽水組以及0.04、0.20和2.00 ng的α-syn組，給予側(cè)腦室連續(xù)注射生理鹽水或α-syn共7 d，采用轉(zhuǎn)棒實驗檢測小鼠運動能力，采用免疫印跡法檢測小鼠黑質(zhì)和紋狀體區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）和MAO-B蛋白表達。

結(jié)果 與生理鹽水組相比，0.20和2.00 ng的α-syn組小鼠在轉(zhuǎn)棒上運動時間明顯縮短（F=4.877，P<0.05），且紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達水平顯著升高（F=9.662，P<0.05），但0.04 ng的α-syn組小鼠運動水平和紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達水平均沒有明顯變化（P>0.05）。各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH和MAO-B蛋白表達水平比較差異均無顯著性（P>0.05）。

結(jié)論 側(cè)腦室注射α-syn可引起小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達增加和運動功能障礙。

[關(guān)鍵詞] α突觸核蛋白;輸注，腦室內(nèi);紋狀體;黑質(zhì);單胺氧化酶;小鼠

[中圖分類號] R338.2

[文獻標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0642-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.134

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1725.016.html;2021-06-29 10：22：32

EFFECT OF INTRACEREBROVENTRICULAR INJECTION OF Α-SYNUCLEIN ON THE EXPRESSION OF MONOAMINE OXIDASE B IN THE SUBSTANTIA NIGRA AND THE STRIATUM

MI Xiaoqing， XIE Junxia， SONG Ning

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine，" Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of intracerebroventricular injection of α-synuclein （α-syn） on the expression of monoamine oxidase B （MAO-B） in the substantia nigra and the striatum of mice.

Methods Male C57BL/6 mice， aged 8 weeks， were randomly divided into normal saline group and 0.04， 0.20， and 2.00 ng α-syn groups. After intracerebroventricular injection of normal saline or α-syn was given for 7 consecutive days， the rotarod test was used to evaluate motor ability， and Wes-

tern blotting was used to measure the protein expression levels of tyrosine hydroxylase （TH） and MAO-B in the substantia nigra and the striatum of mice.

Results Compared with the normal saline group， the 0.20 and 2.00 ng α-syn groups had a significant reduction in the time spent on the rotating rod （F=4.877，Plt;0.05） and a significant increase in the protein expression level of MAO-B in the striatum （F=9.662，Plt;0.05）， while the 0.04 ng α-syn group had no significant changes in motor ability and the protein expression level of MAO-B in the striatum （Pgt;0.05）. There were no significant differences in the protein expression levels of TH and MAO-B in the substantia nigra between these groups （Pgt;0.05）.

Conclusion Intracerebroventricular injection of α-syn can increase the protein expression of MAO-B in the striatum of mice and induce impairment of motor ability.

[KEY WORDS] alpha-synuclein; infusions， intraventricular; corpus striatum; substantia nigra; monoamine oxidase; mice

帕金森?。≒D）是第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，其確切病因至今尚未完全明了[1-3]，其主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺（DA）能神經(jīng)元缺失和路易小體（LB）形成，臨床主要表現(xiàn)有肌強直、靜止性震顫、運動遲緩以及姿勢不穩(wěn)等[4-7]。α-突觸核蛋白（α-syn）是SNCA編碼的由140個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，是LB的主要成分[8-10]。大量研究結(jié)果表明，PD等突觸核蛋白病病人腦脊液中的α-syn水平較正常人顯著降低[11-12]。然而，長期追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PD病人腦脊液中的α-syn水平會隨著疾病進展逐漸回升，而且α-syn水平的升高與PD病人后期運動功能的下降存在緊密聯(lián)系[13-14]。單胺氧化酶B（MAO-B）是一種線粒體膜蛋白，是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要氧化脫氨酶，可分解DA產(chǎn)生3，4-二羥基苯基乙醛（DOPAL）等代謝產(chǎn)物[15-16]。有文獻報道，α-syn以及α-syn 1～103片段均可直接結(jié)合MAO-B而增強其酶活性，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性[17]。

本文通過給予小鼠側(cè)腦室注射不同濃度α-syn，以評價其運動功能以及紋狀體和黑質(zhì)區(qū)MAO-B蛋白表達的變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

實驗動物：SPF級雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于可自由飲水取食、室溫（19±2）℃、濕度（50±5）%、晝夜循環(huán)光照（12 h/12 h）的清潔環(huán)境中。主要試劑：α-syn購自美國rPeptide公司;酪氨酸羥化酶（TH）一抗購自德國Sigma公司;MAO-B一抗購自美國GeneTex公司;Rabbit Anti-β-actin購自中國博奧森公司;Goat Anti-Rabbit IgG二抗購自中國愛必信公司。

1.2 動物分組與處理

將40只實驗小鼠隨機分為生理鹽水組（A組）以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn組（B、C、D組），每組10只。小鼠用異戊烷麻醉后固定在腦立體定位儀上。剪開小鼠顱腦背側(cè)皮膚，用體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液擦拭顱骨表面至顱縫和前后囟清晰可見。確定坐標(biāo)（右側(cè)側(cè)腦室立體定位坐標(biāo)為前囟后0.3 mm、右旁開1.0 mm、深度2.2 mm）后，將長5.2 mm的套管垂直埋入側(cè)腦室2.2 mm。以1 μL/min的流量注射生理鹽水或α-syn 2 μL，每天1次，連續(xù)7 d。

1.3 轉(zhuǎn)棒實驗

小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上適應(yīng)2 min后，將旋轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速設(shè)置為4～40 r/min，使小鼠隨旋轉(zhuǎn)棒自主運動，記錄小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上運動的時間。測量2次（間隔30 min）取平均值。

1.4 免疫印跡法檢測TH和MAO-B蛋白表達

小鼠斷頭，根據(jù)小鼠大腦圖譜取紋狀體和黑質(zhì)樣本并稱質(zhì)量。按照25 μL/mg的比例向樣本中加入蛋白裂解液，充分研磨后以12 000 r/min離心20 min，取上清，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，加入1/4體積的Loading Buffer后95 ℃金屬浴5 min。處理好的蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜（0.45 μm 的PVDF膜）。以50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入一抗TH（1∶3 000）、MAO-B（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）4 ℃孵育過夜，次日用山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL方法顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值，TH和MAO-B蛋白表達水平以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值來表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s形式表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA檢驗）進行多組均數(shù)的比較，繼以Tukey方法進行兩兩均數(shù)間的比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn對小鼠行為學(xué)的影響

生理鹽水組以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn組小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上運動的時間分別為（221.867±38.855）、（213.905±63.634）、（145.556±54.844）和（138.111±40.932）s，4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.877，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比較，0.04 ng α-syn組小鼠運動時間無明顯變化（P>0.05），而0.20和2.00 ng α-syn組小鼠的運動時間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（q=3.907、4.288，P<0.05）。

2.2 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn對紋狀體區(qū)TH和MAO-B蛋白表達的影響

本研究4組小鼠紋狀體區(qū)TH蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。4組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.662，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比較，0.04 ng α-syn組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達水平?jīng)]有明顯的變化（P>0.05），0.20和2.00 ng的α-syn組小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達水平顯著升高（q=4.281、6.993，P<0.05）。見表1。

2.3 側(cè)腦室注射不同濃度α-syn對黑質(zhì)區(qū)TH和MAO-B蛋白表達的影響

本研究4組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH和MAO-B蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，各濃度α-syn組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH和MAO-B蛋白表達水平均沒有明顯改變（P>0.05）。見表2。

3 討" 論

編碼α-syn的SNCA是首個被人們發(fā)現(xiàn)的與PD相關(guān)的常染色體顯性遺傳基因[18]。無論是在遺傳性PD還是在散發(fā)性PD中，α-syn均可以在DA能神經(jīng)元中積聚形成LB[19]。生理狀態(tài)下的α-syn與A組比較，F(xiàn)=9.662，*q=4.281、6.993，P<0.05。

通常被認為是舒展的可溶性結(jié)構(gòu)，但當(dāng)其濃度升高時α-syn易聚合折疊形成寡聚體，對神經(jīng)元膜有毒性作用，可改變膜滲透性，導(dǎo)致鈣大量內(nèi)流，引起膜除極;也可引起細胞氧化損傷，導(dǎo)致細胞死亡[20]。細胞內(nèi)的α-syn還可以被釋放到細胞外。人的腦脊液和血漿中存在一定濃度的α-syn[21]。大量研究發(fā)現(xiàn)，PD病人腦脊液中的α-syn水平降低[11-12]，但隨著疾病進展，α-syn水平回升且與病人的認知、運動功能緊密相關(guān)[13-14]。

單胺氧化酶是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中催化DA、5-羥色胺和去甲腎上腺素等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要氧化脫氨酶。MAO-B通過分解DA產(chǎn)生DOPAL并產(chǎn)生活性氧（ROS）物質(zhì)和內(nèi)源性神經(jīng)毒素[16]。年齡相關(guān)的MAO-B表達增加與自由基損傷和ROS增加存在密切關(guān)聯(lián)，可導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體功能降低，導(dǎo)致黑質(zhì)致密部神經(jīng)元活力降低以至神經(jīng)變性[22]。MAO-B抑制劑常被作為有效的PD治療藥物[23-24]。本研究結(jié)果表明，側(cè)腦室注射α-syn 7 d可引起C57BL/6小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達升高和運動功能障礙，但黑質(zhì)區(qū)MAO-B蛋白表達不變。MAO-B主要位于星形膠質(zhì)細胞，在星形膠質(zhì)細胞激活時MAO-B蛋白表達明顯上調(diào)，因此MAO-B可能作為星形膠質(zhì)細胞激活的生化標(biāo)記物[25]。α-syn可以通過Toll樣受體4（TLR4）激活星形膠質(zhì)細胞[26]。因此我們推測，紋狀體MAO-B表達升高可能與側(cè)腦室注射的α-syn到達紋狀體后激活星形膠質(zhì)細胞有關(guān)，這尚需在后續(xù)實驗中進一步證實。此外，MAO-B是DA酶解途徑之一，當(dāng)MAO-B表達增加時，一方面MAO-B可促進DA

分解;另一方面，DA分解產(chǎn)生的DOPAL還可以激活δ分泌酶，在N103位置裂解α-syn。α-syn以及α-syn 1～103片段均可直接結(jié)合MAO-B而增強其酶活性[17，27]。我們推測，MAO-B表達和活性的增加，可能在未造成DA能神經(jīng)元損傷之前（本實驗觀察到黑質(zhì)和紋狀體區(qū)TH表達均不變）顯著促進了紋狀體區(qū)DA的分解，造成了小鼠運動功能障礙。與其他腦區(qū)相比較，黑質(zhì)中星形膠質(zhì)細胞分布相對較少[28]，這可能是側(cè)腦室注射α-syn未引起黑質(zhì)區(qū)MAO-B蛋白表達變化的原因。

綜上所述，側(cè)腦室注射α-syn可引起C57BL/6小鼠紋狀體區(qū)MAO-B蛋白表達增加和運動功能障礙。本文研究結(jié)果為進一步探討腦脊液中α-syn的變化影響PD疾病進程提供了新的實驗思路和理論依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）