淫羊藿總黃酮和黃芪多糖配伍對骨質疏松大鼠的保護作用

孔令巖 柴儀△ 李倩 常波倫 劉爍煒 暴凱 麻叢叢

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種因骨量低下，骨的纖維結構破壞導致骨脆性增加，從而引起骨折發(fā)生危險性升高的一種全身性疾病[1]。OP患者既可以沒有任何臨床癥狀，也可以表現(xiàn)為四肢、關節(jié)、脊柱等全身骨痛，脊柱發(fā)生病變易導致脆性骨折等[2]。因此，OP已成為醫(yī)學領域亟待解決的重要問題之一。傳統(tǒng)醫(yī)學認為淫羊藿具有補腎壯陽、強筋健骨之功效，臨床上常用于治療腰腿疼，且有利于骨折愈合。淫羊藿的有效成分是淫羊藿總黃酮，具有促進成骨細胞分化和抑制破骨細胞骨吸收的作用[3]。黃芪具有補氣健脾、托瘡生肌之功效，其化學成分主要是黃芪多糖，能夠通過拮抗細胞凋亡及促進成骨細胞的增殖分化來控制骨代謝[4]。因此，本研究將淫羊藿總黃酮和黃芪多糖配伍，旨在觀察補腎健脾法對去勢OP大鼠的保護作用，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

研究所用雄性SD大鼠50只(體質量80～110 g)，中位數(shù)95 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心所提供，動物許可證號為SCXK(冀)2018-1-004。

1.2 實驗藥物及試劑

淫羊藿總黃酮(Epmedium Flavonoid，EF)、黃芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)均為實驗室自制，制備方法參見文獻[5-6]。Ca試劑盒、P試劑盒、BGP試劑盒(南京建成)。

1.3 方法

1.3.1造模方法 大鼠在實驗室內適應飼養(yǎng)7 d后，進行雙側卵巢切除手術，按照(0.4 mL/100 g)劑量注射1%戊巴比妥鈉溶液行腹腔麻醉，手術操作均在無菌的實驗環(huán)境下進行。正常組大鼠切除卵巢周圍等量的脂肪組織，但不切除卵巢，其余操作均與造模組相同。術后，所有大鼠給予青霉素肌內注射，以預防切口感染，連續(xù)注射3 d。最后將大鼠放入單籠中飼養(yǎng)，并放置烤燈烘烤。

1.3.2分組方法 造模成功后，將大鼠隨機分為5組：正常組、模型組、淫羊藿總黃酮組、黃芪多糖組和淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組(各10只)。

1.3.3干預方法 淫羊藿總黃酮組給予淫羊藿總黃酮90 mg/(kg·d)，黃芪多糖組給予黃芪多糖600 mg/(kg·d)，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組給予含有淫羊藿總黃酮和黃芪多糖混懸液690 mg/(kg·d)，正常組和模型組給與等體積生理鹽水。連續(xù)給藥12周，每周測大鼠體質量。

本次實驗中大鼠的使用和處理均參照美國國家衛(wèi)生研究院制定的《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行，所有的動物實驗程序均通過河北醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查和批準。

1.3.4樣本的采集和制備 各組大鼠給以戊巴比妥鈉(0.4 mL/100 g)進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，下腔靜脈插管取血，將血液樣本放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，提取血清，儲存于-20 ℃冰箱中。去左側全段股骨，刮除肌肉組織，蒸餾水沖洗，放入錫紙包裹，標記，并放于-80°冰箱保存。按照試劑盒說明書進行操作，測定血Ca、血P和BGP含量。

1.4 指標測定

按照試劑盒說明書進行操作，測定血Ca、血P和BGP含量。將股骨標本置于三氯甲烷-甲醇混合液中，脫脂72 h，再放入120 ℃烤箱，烘烤60 min，稱重。將稱重后的標本放于800 ℃馬弗爐，12 h后呈白色灰狀，稱重，并溶解于HNO3∶H2O中，測定骨Ca及骨P的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 血Ca、血P和BGP水平

與正常組大鼠相比較，模型組大鼠血Ca、血P和BGP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明卵巢切除導致大鼠出現(xiàn)一定程度的骨質疏松癥狀；與模型組大鼠相比較，各給藥組大鼠血Ca、血P和BGP水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能改善OP大鼠的骨質疏松癥狀；對于BGP水平，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血Ca、血P和BGP水平

2.2 骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量

與正常組大鼠相比較，模型組大鼠骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明OP大鼠骨量減少；與模型組大鼠相比較，各給藥組大鼠骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能使OP大鼠的骨量增加；此外，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量

3 討論

OP是一種由多因素誘發(fā)的骨強度下降、骨微結構被破壞的綜合性代謝性疾病，骨折是其最嚴重也是最常見的并發(fā)癥[7]。OP與年齡密切相關，絕經期婦女由于雌激素水平下降易出現(xiàn)骨質疏松癥狀[8]，表現(xiàn)為骨小梁變小、骨皮質變薄及骨密度(BMD)下降等特征[9]。目前臨床上治療OP主要以抑制骨吸收的二磷酸鹽為主，但易出現(xiàn)下頜骨壞死、非典型性骨折等并發(fā)癥[10]。因此，研究防治OP的新藥具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的補腎中藥淫羊藿是小檗科草本莖葉，首載于《神農本草經》，味辛甘性溫，歸肝腎二經，是補腎壯陽、強筋健骨的要藥[11]。有研究表明，淫羊藿主要成分為黃酮類物質，而酮類物質被證明具有類雌激素樣作用，因此，淫羊藿具有抗OP、調節(jié)雄性發(fā)育、調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗衰老、抑制腫瘤等作用[12]。馮云波等[13]探討淫羊藿總黃酮對OP大鼠的保護作用，將45只3個月齡大鼠按體質量隨機分為三組：正常組(n=15)、模型組(n=15)、淫羊藿總黃酮組(n=15)，結果發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮組大鼠骨皮質較完整，骨量分布較均勻，骨髓內小梁結構較清晰。羅靜華等[14]通過實驗研究，認為淫羊藿黃酮化合物早期通過促進骨質疏松性骨折端血管重建的速度和數(shù)量，促使成骨細胞的分化、趨化與成熟和多種修復性生理因子的聚集，增進鈣鹽吸收、沉著，并在骨折塑性期激活破骨細胞加速骨痂改建，進而改善骨痂內礦化組織分布和顯微結構的連接性使骨折恢復原有外形和強度。黃芪首載于東漢時期的《神農本草經》，已有兩千多年的用藥史[15]，具有補氣健脾、托瘡生肌、升陽舉陷、利水消腫等功效。黃芪的主要化學成分是黃芪多糖，現(xiàn)代研究表明黃芪多糖具有抗OP、抗腫瘤、調節(jié)神經系統(tǒng)等活性，且能改善骨細胞代謝[4]。張宏波等[16]研究黃芪多糖對去試OP大鼠的影響，結果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有抑制骨吸收和促進骨形成的作用，對OP具有預防作用。OP與脾、腎兩臟密切相關，腎主骨生髓，脾為生化之源，若脾腎虧虛，氣血、筋骨失養(yǎng)，易導致OP的發(fā)生。因此，在臨床上依據(jù)OP的發(fā)病機理，可運用補腎健脾的方法作為治療OP的重要原則。有研究表明，補腎健脾中藥能夠明顯改善OP大鼠的骨代謝狀態(tài)，具有抑制骨吸收、促進骨形成的作用[17]。劉振東等[18]研究發(fā)現(xiàn)補腎健脾湯能夠明顯降低OP患者的骨保護素(OPG)水平，增加胰島素樣生長因子(IGFs)水平，改善患者的臨床癥狀。

本研究結果顯示，各給藥組大鼠血Ca、血P和BGP水平均明顯升高，提示淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能改善OP大鼠的骨質疏松癥狀。BGP的變化可代表骨代謝的變化，因此臨床上將BGP作為骨形成的生化參考指標。對于BGP水平，淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果優(yōu)于單藥組，表明兩藥配伍可能存現(xiàn)協(xié)同效果。此外，各給藥組大鼠骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量均明顯升高，表明淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍均能使OP大鼠的骨量增加，且淫羊藿總黃酮+黃芪多糖組效果更顯著。本實驗結果表明對于OP的防治，用補腎壯骨的淫羊藿配伍健脾益氣的黃芪，以達到健脾補腎的功效，與祖國醫(yī)學的整體觀念和辨證論治相一致。

綜上所述，淫羊藿總黃酮和黃芪多糖單用或者配伍對去試OP大鼠均具有一定的治療作用，且配伍組的療效更優(yōu)，不僅能夠提高血Ca、血P和BGP水平，增加骨干質量、骨灰質量、骨Ca及骨P的含量，降低骨折的風險。因此，開展淫羊藿總黃酮配伍黃芪多糖防治OP具有潛在的研究價值，可為補腎健脾法的臨床應用提供實驗依據(jù)。