我國健康豬源大腸桿菌對四環(huán)素類藥物耐藥性的Meta分析

周玲，猶銀俊，龔才偉，呂世明*，譚艾娟，鄭汝青，王劍，廖書丹

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.黔南州養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心動物疫病預防控制站，貴州 黔南 558000；3.貴州大學生命科學學院,貴州 貴陽 550025)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是人和動物腸道內的共生菌及機會致病菌[1]。該菌與多種藥物及多種細菌接觸可形成或獲得耐藥性，再與其他細菌接觸時可將耐藥遺傳因子轉移出去，是潛在的耐藥基因儲存庫，因此這些與健康動物共生的大腸桿菌被認為是耐藥性的指示菌[2]。

四環(huán)素類抗生素(tetracyclines)因價格低廉且毒性較低的優(yōu)點廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，經查閱2000年至2020年的大量文獻，從我國養(yǎng)殖場動物中分離鑒定的大腸桿菌已對四環(huán)素類藥物產生耐藥性，但在時間、地區(qū)上零散不系統(tǒng)。Meta分析是指采用統(tǒng)計方法，將多個獨立的的小型研究采用嚴格、系統(tǒng)的方法進行評價、分析和合成[3]，可以避免單個小樣本臨床試驗的局限性，使結果更全面和可靠。故本研究期望通過Meta分析方法對健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥狀況進行系統(tǒng)評價，并探討耐藥性與時間、空間分布的關系。

1 材料與方法

1.1 搜索和選擇標準

檢索PubMed、EMBASE、EBSCO、Web of science、MD Consult(ClinicalKey)、中國生物醫(yī)學文獻數據庫(SinoMed)、中國國家知識基礎設施(CNKI)、萬方(中國)數據庫、維普數據庫、谷歌學術共10個數據庫，確定2000年1月1日至2020年1月13日發(fā)布的中國豬源大腸桿菌耐藥性的研究文獻。以豬源大腸桿菌及抗菌藥物耐藥性作為相關檢索詞。檢索詞：大腸桿菌、耐藥性、藥物、動物。這些術語與文本搜索相結合，包括：大腸桿菌、抗菌藥物耐藥性、多重耐藥性、四環(huán)素類和豬。在英文文獻中，檢索詞需要添加“中國”，因為英文文獻中會報道其他國家。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準

文獻納入標準如下：可以獲得大腸桿菌四環(huán)素耐藥率的文獻；可獲得大腸桿菌菌株總數(或可用于計算它們的數據)的文獻；發(fā)表日期為2000年1月1日至2020年1月13日的文獻；原始研究文獻；關于動物的報告。

1.2.2 排除標準

文獻排除標準如下：菌株不是來自健康動物，而是來自患病動物或病料的文獻；沒有使用標準方法檢測耐藥性、沒有報告樣本量或數據不適當的文獻；在耐藥性檢測前，大腸桿菌菌株通過其他標準預先選擇，如含有某些基因等文獻；大腸桿菌菌株數少于3株的文獻；市場豬肉來源、豬場環(huán)境來源的文獻；重復數據的文獻；不是來自豬，來自于其他動物的文獻；日期范圍之外的文獻；綜述及統(tǒng)計分析的文獻。

1.3 文獻信息摘錄

閱讀從數據庫中檢索出來文獻的題目、摘要，根據納入條件進行文獻初步篩選；然后通過閱讀全文，根據排除標準進行第二次篩選。用Excel表摘錄下第一作者、發(fā)表時間、樣本量、耐藥菌株數、研究地區(qū)、耐藥率、試驗方法、評判標準等關鍵信息。

1.4 文獻質量評價

根據Ali等[4]的研究，以及Joanna Briggs Institute推薦的批判性評估檢查表[5]進行研究質量評估。檢查表由7個問題組成，每題回答“是”得1分，問題4有2分。每項研究的最終分數在0到8之間。

1.5 統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel軟件進行數據收集及基礎計算，使用Revman 5.3軟件在該薈萃分析中進行合并，參照陳月紅等[6]的方法進行最終結果轉換，效應值、95%置信區(qū)間上限與下限的轉換值即是最終所需要的耐藥率合并值及其95%置信區(qū)間。公式為：效應量的轉換值=效應量/(1+效應量)；95%置信區(qū)間下限的轉換值=95%置信區(qū)間下限值/(1+95%置信區(qū)間下限值)；95%置信區(qū)間上限轉換值=95%置信區(qū)間上限值/(1+上限值95%置信區(qū)間)?；陲@著異質性的可能性，使用卡方檢驗來估計研究之間的異質性，若P>0.10，則認為沒有異質性，采用固定效應模型(F)；若P<0.10，則認為研究間具有異質性，采用隨機效應模型(R)。0%

2 結果

2.1 文獻篩選流程及結果

用計算機檢索了10個電子數據庫，結果見圖1。

圖1 文獻檢索及篩選流程

由圖1可見，檢索PubMed 7篇、EMBASE 3篇、EBSCO 24篇、Web of Science 149篇、MD Consult(ClinicalKey)14篇、中國生物醫(yī)學文獻數據庫(SinoMed)141篇、中國國家知識基礎設施(CNKI)40篇、萬方(中國)數據庫281篇、維普數據庫4篇、Coogle Scholar 5篇，共確定了從2000至2020發(fā)表的668篇文獻。在對標題和摘要進行初步評價后，排除了547篇不相關和重復的文章，其余121篇文章進行全文瀏覽。121篇文獻在瀏覽后，有101篇被排除在外，具體原因有：34篇樣本來自患病動物，32篇沒有使用標準方法檢測耐藥性、沒有報告樣本量或數據不恰當的研究，16篇信息不完整的研究，9篇市場豬肉來源或環(huán)境樣本來源，4篇文獻使用重復數據，3篇文獻菌株已經通過篩選，1篇不在時間范圍以內，1篇來自其他動物，1篇不是原始研究。經篩選后，最后納入20篇文獻進行Meta分析。

2.2 納入研究的基本特征和偏倚風險評價

對經篩選后納入的20篇研究基本情況及質量進行評價，評價得分，見表1。

表1 納入文獻基本情況及質量評分

2.3 Meta分析

2.3.1 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥率

對20篇文獻分不同抗菌藥物進行耐藥率的合并，由于異質性較大(I2>50%)，均采用隨機效應模型。在四環(huán)素耐藥率的分析上，對異質性影響較大的研究進行單個逐步剔除，并仔細閱讀原文發(fā)現，3篇研究[11,13,23]均是來自散養(yǎng)模式喂養(yǎng)的豬群，其耐藥率明顯低于集中飼養(yǎng)的規(guī)?；B(yǎng)豬場，對異質性有較大影響。而1篇研究[26]原文顯示采集樣本為2014至2016年，發(fā)表時間為2018年；在納入文獻質量評價中為最低分4分；與同組類其他文獻存在較大異質性，此處不予合并。豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物的耐藥數據進行分別合并分析后，經過用文獻[6]的方法進行轉換，最終轉化后的結果見表2顯示。耐藥率由高到低依次是：土霉素97.0%(95%置信區(qū)間為90.8%～99.1%,P<0.01)、金霉素94.7%(95%置信區(qū)間為91.9%～97.5%,P<0.01)、四環(huán)素93.5%(95%置信區(qū)間為90.8%～95.3%,P<0.01)、強力霉素74.4%(95%置信區(qū)間為58.5%～85.7%,P<0.01)、地美環(huán)素70.6%(95%置信區(qū)間為63.1%～77.2%)、替加環(huán)素34.2%(95%置信區(qū)間為31.0%～37.5%)、米諾環(huán)素33.2%(95%置信區(qū)間為3.9%～62.4%,P=0.03)。

表2 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物的耐藥情況

2.3.2 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素耐藥率的亞組分析

對符合條件的17項有關大腸桿菌對四環(huán)素耐藥的研究共3 796株菌株做亞組分析，分別形成不同地區(qū)、不同省份、不同時間段的亞組分析，結果如表3所示。在四環(huán)素耐藥的亞組分析上，對包含4個以上的研究存在異質性，則尋找異質性來源，進行敏感性分析發(fā)現，在四環(huán)素耐藥率的亞組分析上，從地理分區(qū)來看，除未收集到數據的西北外，耐藥率從高到低依次是華北99.3%(95%置信區(qū)間為95.0%～99.9%)、華中95.1%(95%置信區(qū)間為82.5%～98.8%)、華北與華中94.1%(95%置信區(qū)間為86.6%～97.6%)、華東92.8%(95%置信區(qū)間為90.2%～94.8%)、華南88.6%(95%置信區(qū)間為71.8%～96.0%)、西南88.4%(95%置信區(qū)間為31.0%～99.2%)、東北87.3%(95%置信區(qū)間為81.8%～91.3%)，耐藥率均高于80%，而華北耐藥率最高達99.3%；從不同省份來看，除西藏自治區(qū)耐藥率低于50%，為40.5%(95%置信區(qū)間為32.4%～49.0%)；其余上海市、廣東省、山東省、貴州省、福建省、江蘇省、北京市、吉林省、河南省、北京市與湖北省組共10省的耐藥率均超過80%，北京市耐藥率最高，為99.3%(95%置信區(qū)間為95.0%～99.9%)；從時間段來看，2005至2010、2011至2015、2016至2020分別為94.5%(95%置信區(qū)間為88.9%～97.4%)、92.3%(95%置信區(qū)間為89.4%～94.5%)、96.3%(95%置信區(qū)間為93.0%～98.1%)。

表3 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素藥物耐藥率的亞組分析表

2.3.3 健康豬源大腸桿菌強力霉素耐藥率亞組分析

對符合條件的9項有關大腸桿菌對強力霉素耐藥的研究共2 696株菌株做亞組分析，分別形成不同地區(qū)、不同省份、不同時間段的亞組分析，結果如表4所示。在強力霉素耐藥率的亞組分析上，從地理分區(qū)來看，除未收集到數據的西北、東北外，耐藥率從高到低依次是華北98.4%(95%置信區(qū)間為24.0%～100%)、華中78.1%(95%置信區(qū)間為63.0%～88.2%)、西南76.6%(95%置信區(qū)間為54.5%～90.0%)、華南68.3%(95%置信區(qū)間為55.8%～78.5%)、華東61.1%(95%置信區(qū)間為29.0%～85.9%)，耐藥率均高于50%，而華北耐藥率最高達98.4%。從不同省份來看，貴州省、福建省、上海市、河北省、廣東省、河南省、四川省7省的耐藥率均超過50%；河北省耐藥率最高，都為100.0%(95%置信區(qū)間為83.0%～100.0%)；廣東省、上海市耐藥率較低，分別為68.3%(95%置信區(qū)間為55.8%～78.5%)、59.3%(95%置信區(qū)間為10.7%～94.6%)。從時間段來看，2011至2015與2016至2020分別為74.4%(95%置信區(qū)間為51.0%～89.0%)、75.7%(95%置信區(qū)間為47.6%～91.4%)。

表4 健康豬源大腸桿菌強力霉素耐藥率的亞組分析表

2.3.4 漏斗圖

漏斗圖是一種以視覺觀察來識別是否存在發(fā)表偏倚的方法。小樣本所得的離散度較大，常處于漏斗圖的底部；大樣本離散度較小，處于頂部。健康豬源大腸桿菌對四環(huán)素耐藥率漏斗圖基本對稱(圖2)，顯示樣本量較大且偏倚較小。

圖2 健康豬源大腸桿菌對四環(huán)素耐藥率的漏斗圖

3 討論

我國畜牧業(yè)生產中使用抗菌藥始于20世紀70年代，并且于2017年開始施行“減抗”計劃，2020年成為我國飼料全面強制性禁抗的起點。健康動物體內共生性大腸桿菌作為耐藥指示菌和耐藥基因儲存庫，對其進行耐藥性監(jiān)測尤為重要。有研究表明，來源于患病動物的大腸桿菌耐藥性高于健康動物[27-29]。

本研究對健康豬源大腸桿菌抗四環(huán)素類藥物耐藥率的Meta分析發(fā)現：四環(huán)素類藥物耐藥率從高到低依次是：土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素、地美環(huán)素、替加環(huán)素。替加霉素耐藥水平最低，為34.2%。從相關機制分析，細菌在體外時對四環(huán)素的耐藥性產生較慢,但體內同種之間會呈交叉耐藥[30]，以致耐藥現象嚴重。何濤等[31]研究新型變異體tet(X)可介導一二代四環(huán)素類藥物耐藥；孫堅等[32]研究tet(X4)基因轉入大腸桿菌能顯著增強其對所有四環(huán)素的耐藥性。同時，由于耐藥基因能通過質粒傳播[33]，有很高的可移動性，所以在較強的藥物選擇壓力下可能促進耐藥性在食物鏈及環(huán)境中傳播，造成耐藥嚴重。因此，養(yǎng)殖業(yè)應少用四環(huán)素類藥物，可使用抗生素替代品。亞組分析結果顯示，我國健康豬源大腸桿菌四環(huán)素、強力霉素耐藥率在各地區(qū)、各省份存在差異性，耐藥狀況嚴重；在不同時間段中，隨時間的推移耐藥率沒有明顯下降。本研究存在一定局限性，因沒有獲得足夠數量的不同年份的四環(huán)素類藥物耐藥率的研究，故無法詳細跟蹤了解四環(huán)素類藥物耐藥率隨年限的變化。

本研究異質性較大與以下因素有關：第一，受研究分析因子的設定影響，如不同研究所選用的豬場、抽樣方法及樣本量不同均對豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物合并耐藥率的結果造成影響。還有各原始文獻為單個組別的率，屬觀察性研究，不能實現隨機化，穩(wěn)定性不同于兩個組的研究，更容易受到偏倚風險的影響，所以在合并時統(tǒng)計學異質性一般會比較大，國內發(fā)表的很多關于單個率的Meta分析也可證實這一點[34]。第二，受不同地區(qū)豬場的數量、規(guī)模、分布等差異的影響。華中、華南和東北地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大，其藥物使用量也大，導致該區(qū)域對四環(huán)素、強力霉素的耐藥率較高。第三，與使用時間長短有關，上世紀70年代常用的飼料添加劑就包括土霉素，四環(huán)素、金霉素等，因此，大腸桿菌對這些抗生素顯示了較高的耐藥性，應用較晚的替加環(huán)素及不常使用的米諾環(huán)素在養(yǎng)殖場并沒有很高的耐藥水平，藥物的使用時間差異也會影響研究結果。第四，與飼養(yǎng)模式有關，如孫理云等[24]的研究，在異質性分析中發(fā)現，對于散養(yǎng)模式的豬群，其耐藥率明顯低于集中規(guī)?；曫B(yǎng)的豬群。本研究還存在許多不足：研究是單組變量的Meta分析；缺乏對照設計；養(yǎng)殖場飼養(yǎng)模式等因子未納入研究；某些亞組分析包含的文獻數量較少，納入的文獻調查地區(qū)來源部分地區(qū)，這些對結果都可能存在一定影響。