腸上皮細(xì)胞在動(dòng)物腸黏膜免疫調(diào)節(jié)中的功能

楊敏卉，連思琪，劉家奇，顧宣強(qiáng)，朱國(guó)強(qiáng)，夏芃芃 (1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 比較醫(yī)學(xué)研究院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)處于腸腔病原和腸黏膜固有層免疫系統(tǒng)的交界處，不僅作為分隔腸腔內(nèi)容物和固有層免疫細(xì)胞的物理屏障，還能感知腸腔微環(huán)境的變化并應(yīng)對(duì)局部免疫反應(yīng)，是機(jī)體免疫防御的第一道防線。正常機(jī)體中，IECs雖然持續(xù)暴露于由不同抗原性食物和多達(dá)1 014個(gè)腸腔細(xì)菌組成的復(fù)雜微環(huán)境中，卻能夠保持對(duì)腸道共生菌的低反應(yīng)性，并能對(duì)病原體等有害刺激及時(shí)地產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[1]；以IECs為主體構(gòu)成的腸黏膜受損是腸道疾病的主要表現(xiàn)，黏膜免疫反應(yīng)是黏膜損傷的生理病理基礎(chǔ)，腸黏膜免疫系統(tǒng)失調(diào)是導(dǎo)致炎癥性、細(xì)菌性等腸道疾病發(fā)生的主要原因[2]。本研究總結(jié)各種IECs在腸黏膜免疫中發(fā)揮的作用，旨在為探索動(dòng)物腸道疾病治療新思路提供參考。

1 IECs 的分類

腸道上皮由折疊的細(xì)胞單層構(gòu)成，細(xì)胞單層內(nèi)陷到間充質(zhì)中形成腸隱窩，伸入腸腔形成的指狀突起稱為微絨毛，干細(xì)胞位于隱窩的基底部，是腸上皮快速和永久更新的主要承擔(dān)者。在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，干細(xì)胞分化產(chǎn)生的各種IECs(除潘氏細(xì)胞外)沿隱窩向上遷移，在腸上皮屏障中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能(圖1)[3]。目前在小腸上皮中已經(jīng)鑒定并廣泛研究的IECs分為兩類：吸收型細(xì)胞，包括柱狀上皮細(xì)胞(columnar epithelial cells)，主要負(fù)責(zé)吸收營(yíng)養(yǎng)，發(fā)揮物理屏障作用；分泌型細(xì)胞：包括分泌黏液的杯狀細(xì)胞(goblet cells)，產(chǎn)生抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)的潘氏細(xì)胞(paneth cells，PCs)和專職分泌激素的腸內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cells，EECs)。結(jié)腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與小腸上皮細(xì)胞非常相似，區(qū)別在于結(jié)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞較多、沒(méi)有微絨毛，且隱窩中沒(méi)有PCs。除以上4種人們熟知的 IECs 外，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者開始關(guān)注簇狀細(xì)胞(tuft cells)和M 細(xì)胞(microfold cells，M cells)的作用和功能，然而這兩種細(xì)胞的分化機(jī)制尚不明確[3]。

圖1 腸上皮細(xì)胞參與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)途徑[2-10]

2 IECs間的緊密連接

小腸柱狀上皮細(xì)胞又稱腸細(xì)胞，是腸上皮的主要細(xì)胞類型，不僅具有吸收和消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，還有助于維持腸黏膜物理、生化屏障的完整性。IECs 之間的緊密連接(tight junction，TJ)封閉了腸上皮的細(xì)胞間隙，防止親水性抗原被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入腸黏膜固有層。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)能夠抵達(dá)上皮層，從腸道 TJ 分子之間伸出樹突以捕獲腸腔細(xì)菌等抗原，并通過(guò)表達(dá)occludin等緊密連接蛋白以維持腸上皮屏障的完整性，DCs 和 IECs 之間的這種互作可進(jìn)一步激活腸黏膜固有層的免疫應(yīng)答(圖1)[2]。

TJ 受肌球蛋白輕鏈激酶和蛋白激酶C 等信號(hào)分子控制，其完整性受飲食成分和腸道微環(huán)境等調(diào)節(jié)，TJ 的表達(dá)水平可作為檢測(cè)腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)是否完整、功能有無(wú)異常的指標(biāo)[11]。

鈣黏蛋白等細(xì)胞因子也能調(diào)節(jié)腸道上皮屏障的完整性和滲透性，E-鈣黏蛋白在上皮細(xì)胞間形成黏附連接，其表達(dá)基因水平下調(diào)會(huì)誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)有關(guān)。E-鈣黏蛋白基因缺陷型小鼠，在葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodiumsalt，DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎的過(guò)程中表現(xiàn)出過(guò)度的炎癥[12]。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepitheliallymphocytes，IELs)又稱黏膜T細(xì)胞群，攜帶 αβ-或γδ-鏈T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)。

TCR γ δ T 細(xì)胞缺陷型小鼠的IELs 水平下調(diào)，各種TJ分子(如閉合蛋白3、閉合小環(huán)蛋白ZO-1)表達(dá)減少，腸道對(duì)寄生蟲和病原菌的抵御能力降低[13]。此外，IELs和 IECs之間的互作還能抵御病毒感染，比如，IELs能誘導(dǎo)IECs 產(chǎn)生抗病毒干擾素，從而降低腸道對(duì)諾如病毒(norovirus，NV)的易感性[14]。

髓系分化主要反應(yīng)基因(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)等微生物模式識(shí)別信號(hào)分子不僅能啟動(dòng)免疫應(yīng)答，還可以通過(guò)影響TJ調(diào)節(jié)腸上皮屏障完整性。

小鼠結(jié)腸模型研究顯示，若IECs中缺少識(shí)別微生物相關(guān)分子模式(microbe associatedmolecular pattern，MAMP)的MyD88，則會(huì)導(dǎo)致TJ減弱、上皮再生減少、炎癥反應(yīng)上調(diào)[15]。

腸道內(nèi)微環(huán)境的改變也有調(diào)節(jié)TJ的作用，當(dāng)腸道內(nèi)微生物失調(diào)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)等蛋白水解菌的數(shù)量增加時(shí)，蛋白酶濃度會(huì)不斷升高，過(guò)多的蛋白酶能夠消化TJ 分子，破壞腸上皮屏障的完整性[16]。腸道微生物的代謝產(chǎn)物(如丁酸鹽)也具有抗炎和保護(hù)黏膜屏障完整性的功能，以仔豬飼養(yǎng)為例，在飼料中添加丁酸鹽，會(huì)影響腸黏膜上皮中TJ的數(shù)量，從而改變腸上皮屏障的通透性[11]。

3 腸上皮細(xì)胞與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)

3.1 杯狀細(xì)胞

3.1.1杯狀細(xì)胞的分泌產(chǎn)物 杯狀細(xì)胞是專職合成和分泌黏蛋白(mucins，MUC)的分泌型IECs。MUC 由幾個(gè)含有蘇氨酸和色氨酸的重復(fù)基序，以及可變的O-聚糖(O-linked glycans)結(jié)構(gòu)域組成[2]。其中，O-聚糖是細(xì)菌的附著位點(diǎn)和能量來(lái)源，MUC的O-糖基化減少會(huì)阻礙細(xì)菌定植，影響腸黏膜上皮與腸腔細(xì)菌互作，而無(wú)菌(germ free，GF)小鼠 MUC2 的 O-聚糖水平較低。含糖水平高的聚合MUC能夠誘導(dǎo)腸隱窩中PCs 產(chǎn)生AMPs(如β-防御素)，并使其濃度維持在較高水平，從而保證抗菌作用[1]。

由MUC構(gòu)成的黏蛋白層又稱黏液層，兼具潤(rùn)滑和物理屏障功能，細(xì)菌不能通過(guò)其形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。黏液層有兩種類型：附著層(或稱堅(jiān)固層)；非附著層(或稱松散層)。正常機(jī)體中，小腸只有一層不附著于 IECs 的黏液層；而結(jié)腸有兩層黏液層，內(nèi)層可以防止IECs 與外層黏液層中的細(xì)菌直 接接觸[17]。與健康人相比，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者由于杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，其上皮表面黏液層較為稀薄[18]。在杯狀細(xì)胞分泌的 MUC家族中，MUC2 含量最高。有小鼠試驗(yàn)顯示，若小鼠腸道中缺乏MUC2，腸腔細(xì)菌會(huì)直接接觸IECs，誘發(fā)結(jié)腸炎[18]。共生菌能刺激杯狀細(xì)胞分泌MUC，且受金屬蛋白酶 meprin β調(diào)節(jié)；meprin β 缺陷的GF小鼠小腸中，MUC2 表達(dá)下調(diào)，黏液變得稀薄且緊貼腸上皮，其結(jié)腸黏液層可被細(xì)菌滲透[19]。由此可見，MUC 在腸上皮屏障中發(fā)揮物理屏障和免疫調(diào)節(jié)的雙重功能，但MUC和IECs、免疫細(xì)胞之間的關(guān)系和調(diào)控方式仍不清楚，該蛋白在動(dòng)物腸道疾病中的應(yīng)用也有待研究。

另一種杯狀細(xì)胞主要分泌產(chǎn)物為三葉因子3(trefoil factors，TFF)，又稱小腸三葉因子ITF(intestinal trefoil factors，ITF)，其由杯狀細(xì)胞特異性表達(dá)，是腸黏膜損傷的快速修復(fù)反應(yīng)肽，能與MUC2 中富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，影響?zhàn)ひ旱酿ざ?，并促進(jìn) IECs 增殖、遷移，有利于上皮損傷修復(fù)[20]。共生菌的脂蛋白受體與杯狀細(xì)胞結(jié)合后，經(jīng)Toll 樣受體2(Tolllike receptor 2，TLR2)途徑誘導(dǎo) ITF 表達(dá)，參與維持腸上皮屏障的完整性[21],缺乏ITF 的小鼠極易患結(jié)腸炎，而人為給予ITF 可有效緩解IECs 凋亡，并促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移以覆蓋被侵蝕的上皮表面[2]。

3.1.2杯狀細(xì)胞數(shù)量提示炎癥反應(yīng) 由輔助型T細(xì)胞 2(T helper 2 Cell，Th2)介導(dǎo)的Ⅱ型黏膜免疫反應(yīng)和寄生蟲感染引起的杯狀細(xì)胞增生非常顯著，先天性淋巴樣細(xì)胞(innatelymphoid cells，ILCs)和肥大細(xì)胞等先天性免疫細(xì)胞也能調(diào)控杯狀細(xì)胞的增殖。與炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL-4、IL-9、IL-13 等細(xì)胞因子能刺激杯狀細(xì)胞增生，產(chǎn)生大量黏液[22]。杯狀細(xì)胞的分化由SAM 指向結(jié)構(gòu)域的ETS 轉(zhuǎn)錄因子(SPDEF)調(diào)控，IL-4和IL-13可以激活 STAT6 信號(hào)通路，刺激SPDEF 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分化、增生[4]。研究發(fā)現(xiàn)，除Th2 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)外，由ILC2產(chǎn)生的IL-13可直接刺激腸隱窩的干細(xì)胞，促進(jìn)杯狀細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生，而IL-22 缺陷型小鼠在毛滴蟲感染腸道時(shí)，黏蛋白分泌量較野生型小鼠減少[5]?？梢娔c道微環(huán)境刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)杯狀細(xì)胞的分化、增殖的影響較為顯著，因此，杯狀細(xì)胞的數(shù)量可作為炎癥反應(yīng)程度的參考指標(biāo)，目前在斷奶仔豬腹瀉等動(dòng)物腸道疾病的研究中已有相關(guān)應(yīng)用報(bào)道[4]。

3.1.3杯狀細(xì)胞相關(guān)抗原通道 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞位于濾泡相關(guān)上皮(follicle associated epithelial，F(xiàn)AE)中，能由杯狀細(xì)胞相關(guān)抗原通道(goblet-associated antigen passages,GAPs)介導(dǎo)，將抗原轉(zhuǎn)運(yùn)給下方黏膜固有層中的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)，激活免疫應(yīng)答。該機(jī)制能由共生菌通過(guò)MyD88途徑激活[6]，腸腔中的右旋糖酐、卵清蛋白等可溶性小分子抗原通過(guò)杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜固有層中的 CD103+DCs 中，CD103+DCs 隨后遷移至腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes，MLN)，誘導(dǎo)具有特異性的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)歸巢(圖1)，以產(chǎn)生口服耐受；從杯狀細(xì)胞缺陷型小鼠腸道中分離的CD103+DCs 對(duì)T 細(xì)胞的抗原提呈明顯減少[23]。

綜上所述，杯狀細(xì)胞分泌的MUC 能阻礙腸腔細(xì)菌定植，保護(hù)腸黏膜免受病原菌侵襲；其在小腸中特異性分泌的ITF 在保護(hù)腸上皮屏障完整性中發(fā)揮重要作用；杯狀細(xì)胞的數(shù)量可作為觀測(cè)炎癥反應(yīng)程度的動(dòng)態(tài)指標(biāo)；此外，近年發(fā)現(xiàn)的GAPs 介導(dǎo)的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)通道參與了腸黏膜的免疫應(yīng)答，但該機(jī)制由何種分子介導(dǎo)，受哪些信號(hào)通路調(diào)控，以及該轉(zhuǎn)運(yùn)通道在口服靶向給藥方面是否有臨床意義，目前尚不明確。

3.2 “殺菌守門人”——潘氏細(xì)胞PCs位于小腸隱窩基底部的干細(xì)胞之間，雖然腸道上皮每4～7 d 完全更新1次，但PCs的壽命可維持約2個(gè)月，這顯示了其在腸黏膜免疫系統(tǒng)中的特殊地位，被稱為腸黏膜屏障中的“殺菌守門人”[2,20]。PCs的分泌顆粒中含有高濃度的α-防御素、溶菌酶、Ⅱ型分泌型磷脂酶A2(type Ⅱ secretory phospholipase A，sPLA2)和 C 型凝集素等AMPs，能控制小腸腔內(nèi)的微生物密度，保護(hù)腸隱窩干細(xì)胞免受病原菌的侵襲，創(chuàng)造并維持干細(xì)胞生成、存活和更新所需的腸隱窩無(wú)菌環(huán)境，即生態(tài)位[2]。

防御素可選擇性地破壞細(xì)胞膜，PCs 能夠分泌α-防御素 5 和 α-防御素 6。氧化型α-防御素6可形成納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，捕獲鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)并防止其跨上皮移位[21]。α-防御6經(jīng)硫氧還蛋白依賴方式氧化后，可殺死共生雙歧桿菌[26]。在小鼠的小腸隱窩中，防御素的質(zhì)量濃度可達(dá)15～100 g/L，該濃度至少是其體外最低殺菌濃度的 1 000 倍，因此，防御素能有效維持干細(xì)胞的生態(tài)位[26]。當(dāng)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、胞壁二肽等細(xì)菌抗原被NOD2 等模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別時(shí)，能夠誘導(dǎo) PCs 分泌防御素，NOD2 純合突變的宿主更易罹患克羅恩病(crohn's disease，CD)[27]。PCs顆粒內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase7，MMP7)參與PCs脫顆粒釋放防御素的過(guò)程。MMP7 缺失型小鼠腸道內(nèi)活化的α防御素水平較低，與野生型小鼠相比，傷寒沙門菌在MMP7 缺失型小鼠腸道中存活的數(shù)量更多，毒力也更強(qiáng)[28]。

溶菌酶主要作用于革蘭陽(yáng)性菌，能夠催化革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁多糖成分中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4-糖苷鍵水解，破壞肽聚糖的穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡[8]。sPLA2釋放花生四稀酸來(lái)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其正電荷性質(zhì)使其能穿透細(xì)菌胞壁，尤其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌殺傷性更強(qiáng)[2]。C型抗菌凝集素 RegⅢγ 能與細(xì)胞壁中的肽聚糖結(jié)合，抑制革蘭陽(yáng)性菌生長(zhǎng)。小鼠體內(nèi)RegⅢγ下調(diào)會(huì)導(dǎo)致小腸上皮的共生菌聚集性降低，使共生菌更易移位、定植，誘發(fā)結(jié)腸炎[29]。

3.3 腸內(nèi)分泌細(xì)胞的免疫-內(nèi)分泌軸EECs 在整個(gè)胃腸道黏膜上皮呈彌散分布，占整個(gè)胃腸腔上皮細(xì)胞比例不到1%，但其數(shù)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)機(jī)體其他部位內(nèi)分泌腺中內(nèi)分泌細(xì)胞的總和，因此構(gòu)成了體內(nèi)最大最復(fù)雜的內(nèi)分泌器官[30]。根據(jù)其分泌的激素分類，哺乳動(dòng)物細(xì)胞有至少20個(gè)EECs 亞群：如分泌胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide，GLP)的L細(xì)胞、分泌胃抑素的K細(xì)胞、分泌縮膽囊素的I細(xì)胞、分泌5-羥色胺的 EC 細(xì)胞等。胃腸道分泌的具有調(diào)節(jié)功能的肽類有40 多種，包括胃腸激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子等，每種EECs可合成并分泌1種或多種調(diào)節(jié)肽或活性分子，目前已知的胃腸激素已超過(guò)20種[2]。不同的EECs 具有不同的化學(xué)感應(yīng)系統(tǒng)，感應(yīng)并調(diào)控腸腔內(nèi)成分[31]。此外，腸道內(nèi)分布有豐富的神經(jīng)元，EECs、免疫細(xì)胞和這些神經(jīng)元之間的雙向調(diào)節(jié)軸被稱為“腸-腦軸”(gut-brain axis，GBA)；腸腔微生物也通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮協(xié)同作用，參與“微生物-腸-腦軸”(microbe-gut-brain axis，MGBA)調(diào)節(jié)[27]，本課題組構(gòu)建禽源大腸桿菌致新生兒大腸桿菌型腦膜炎小鼠模型的研究正是基于MGBA展開的[32]。

腸道內(nèi)短鏈脂肪酸、微生物組分等會(huì)影響EECs 的分化、增殖及其亞群比例。L 細(xì)胞能表達(dá)短鏈脂肪酸受體，當(dāng)小鼠和人的腸道受到腸腔細(xì)菌代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸刺激時(shí)，L細(xì)胞數(shù)量明顯增加[33]。LPS 和細(xì)菌鞭毛蛋白等激活 TLR4、TLR5、TLR9后，會(huì)引起 EECs分泌膽囊收縮素[34]。GF 小鼠的 EECs 數(shù)量明顯少于普通小鼠，這也證明腸道細(xì)菌的刺激會(huì)影響EECs 的分化[35]。

腸道感染和炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，I 細(xì)胞的數(shù)量和縮膽囊素分泌上調(diào)，并能刺激Th2產(chǎn)生IL-4、IL-13，從而減少被感染小鼠的攝食量。缺乏Th2 信號(hào)的小鼠，在腸道炎癥期間食物攝入量不會(huì)減少，這可能是因?yàn)門h2和EECs之間的相互作用能誘導(dǎo)炎癥相關(guān)免疫應(yīng)答，控制食物攝入[36]。5-羥色胺能夠作用于多種免疫細(xì)胞，刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可以直接誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白。炎癥狀態(tài)下，EECs的數(shù)量和腸道激素分泌量上調(diào)，IBD 患者腸道中 EC 細(xì)胞(分泌 5-羥色胺)、L細(xì)胞(分泌 GLP-1 和GLP-2)的數(shù)量顯著增加，EECs 分泌的IL-17C也有所增多[37]。

以上研究表明，腸腔內(nèi)成分(飲食成分和微生物)、EECs和免疫細(xì)胞之間的三重相互作用有利于維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，EECs的這種免疫-內(nèi)分泌軸有可能成為腸道疾病的治療靶點(diǎn)。在預(yù)防斷奶仔豬腹瀉等動(dòng)物腸道疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)肽類調(diào)控EECs 分泌，調(diào)節(jié)動(dòng)物攝食量，維持腸道微生物群平衡，能夠保護(hù)腸黏膜屏障完整性，減少炎癥發(fā)生[34]。然而這種多界面腸道相互作用背后的分子機(jī)制尚不明確，其在抵御病原感染方面發(fā)揮的功能還需要進(jìn)一步研究。

3.4 簇狀細(xì)胞和M細(xì)胞的新探索

3.4.1簇狀細(xì)胞的抗蠕蟲功能 簇狀細(xì)胞為刷狀、凹陷、纖維泡狀細(xì)胞，約占IECs 的0.4%，其功能的相關(guān)研究一直處于停滯狀態(tài)。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，簇狀細(xì)胞與ILC2s相互作用，在抵御寄生蠕蟲的感染性免疫反應(yīng)中扮演重要角色[17]。簇狀細(xì)胞的抗蠕蟲過(guò)程稱為“簇狀細(xì)胞-ILC2 軸”：簇狀細(xì)胞受蠕蟲刺激后表達(dá)IL-25，而IL-25 能激活局部ILC2 產(chǎn)生IL-13，IL-13又以IL-13Rɑ1依賴方式作用于上皮干細(xì)胞，促進(jìn)簇狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分化、增生，累積大量黏蛋白并釋放，最終將寄生蟲從腸道排出。此外，IL-25誘導(dǎo)ILC2 表達(dá)IL-5、IL-9和IL-13，均能激活嗜酸性粒細(xì)胞增生、腸道平滑肌收縮等先天性Ⅱ型炎癥反應(yīng)，抵抗蠕蟲感染(圖1)。ILC 的阻遏蛋白A20能抑制IL-13 等的表達(dá)，敲除ILC中的A20 基因能夠促進(jìn)“簇狀細(xì)胞-ILC2 軸”反應(yīng)，延長(zhǎng)Ⅱ型炎癥反應(yīng)時(shí)間[5]。

此外，有學(xué)者認(rèn)為簇狀細(xì)胞上的化學(xué)感受器可能是一類新的PRRs，能感知原蟲、蠕蟲和細(xì)菌產(chǎn)生琥珀膽堿，通過(guò)GTP 結(jié)合蛋白ɑ-味蛋白激活非選擇性陽(yáng)離子通道上的瞬時(shí)受體電位5 亞型通道(TRPM5)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子外流、胞外鈉離子內(nèi)流，導(dǎo)致膜去極化、興奮傳遞，激活免疫應(yīng)答。此外，TRPM5 基因?yàn)榇貭罴?xì)胞分化、增殖所必需，TRPM5 缺陷型小鼠對(duì)寄生蟲感染的抵抗力顯著降低[8]。

可見，簇狀細(xì)胞在腸黏膜免疫中有抗蠕蟲作用。然而，簇狀細(xì)胞怎樣通過(guò)化學(xué)感受通路識(shí)別病原，細(xì)胞膜去極化如何發(fā)揮生物學(xué)功能，以及如何與腸上皮其他細(xì)胞協(xié)調(diào)作用等問(wèn)題還有待進(jìn)一步的探索。

3.4.2腸黏膜免疫的“門戶”——M細(xì)胞 M細(xì)胞又稱濾泡相關(guān)上皮細(xì)胞，F(xiàn)AE中大約有5%的細(xì)胞是M細(xì)胞。M細(xì)胞因其頂端表面有短而不規(guī)則的微絨毛而具有獨(dú)特的形態(tài)特征，這使它們很容易接觸腸腔抗原[9]。除此之外，M細(xì)胞還有一個(gè)位于細(xì)胞基質(zhì)外層的“口袋”結(jié)構(gòu)，可將細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)至該“口袋”中的淋巴細(xì)胞或APCs(如 DCs、B細(xì)胞)[9]。位于派伊爾結(jié)(peyer's patches，PP)的皮下穹隆區(qū)域(sub-epithelial dome region，SED)的 CX3CR1+DCs可通過(guò)M 細(xì)胞的跨上皮孔隙將其樹突伸入腸腔，以協(xié)助抗原轉(zhuǎn)運(yùn)(抗原從腸腔被攝取至PP)，從而啟動(dòng)腸黏膜特異性免疫，如產(chǎn)生特異性分泌型免疫球蛋白A(secretory Immunoglobin A，sIgA)和CD4+T細(xì)胞等。FAE 產(chǎn)生的CXCL16和CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生的CXCR6 參與了SED區(qū)CD4+T細(xì)胞的招募(圖1)[10]。CCR6相關(guān)信號(hào)通路也參與 M 細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的互作，CCR6缺陷型小鼠SED中的B細(xì)胞和CD4+Tregs的比例下調(diào)，M細(xì)胞數(shù)量減少；將CCR6hiCD11cintB 細(xì)胞從野生型小鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)至 CCR6 缺陷小鼠中，可恢復(fù)其M細(xì)胞水平[38]。

由sIgA 介導(dǎo)的M細(xì)胞跨上皮抗原轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，是抗原提呈的一個(gè)重要組成部分，通過(guò)該機(jī)制M 細(xì)胞能快速攝取sIgA包被的抗原[39]。Dectin1是DC相關(guān)性C 型凝集素家族的一種Ⅱ型跨膜蛋白，熒光標(biāo)記的sIgA 先與FAE 中M細(xì)胞上的Dectin1結(jié)合，介導(dǎo)抗原跨胞膜轉(zhuǎn)入 M 細(xì)胞(胞吞作用)，隨后抗原在 M 細(xì)胞基底外側(cè)膜處胞外分泌(胞吐作用)，并被SED 中的 DCs 捕獲(圖1)。利用抗Dectin1 蛋白封閉抗體，會(huì)降低 sIgA 介導(dǎo)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至 M細(xì)胞的有效性[38]。通過(guò)該跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，口服的HIV 抗原p24gag能與 sIgA 結(jié)合，并通過(guò)M 細(xì)胞有效轉(zhuǎn)移 PP，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生可分泌sIgA和IFN-γ 的細(xì)胞。免疫小鼠感染表達(dá)p24的重組牛痘病毒后，病毒載量顯著下調(diào)，疾病癥狀也明顯減輕[40]。

M 細(xì)胞不僅能夠運(yùn)輸微生物，還能運(yùn)輸乳膠珠、脂質(zhì)體、鐵蛋白和外源凝集素等顆粒物，因此M細(xì)胞不僅作為啟動(dòng)腸黏膜免疫應(yīng)答的“門戶”，也是靶向口服給藥的一個(gè)潛在靶標(biāo)。

例如，一種口服的M細(xì)胞特異性單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)被用作黏膜接種的有效載體，M細(xì)胞上特異表達(dá)的抗α(1，2)-巖藻糖碳水化合物部分(NKM16-2-4)能與破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid，TT)或肉毒毒素(botulinum toxoid，BT)偶聯(lián)，NKM16-2-4的 mAb 與霍亂毒素(一種黏膜佐劑)聯(lián)合后，通過(guò)口服給藥，使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的TT、BT 特異性的IgG和IgA[41]。

值得注意的是，M 細(xì)胞表面的GP2、C5a 等多種受體，可介導(dǎo)抗原進(jìn)入腸腔，經(jīng) M 細(xì)胞跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜固有層的淋巴組織中，產(chǎn)生免疫應(yīng)答[2]。因此，這些與抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的M 細(xì)胞表面受體分子也是黏膜接種的潛在靶點(diǎn)。GP2是一種與磷脂酰肌醇連接的糖蛋白，其表達(dá)于M 細(xì)胞表面，在磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C的作用下可經(jīng)細(xì)胞膜釋放。有報(bào)道稱，GP2 能夠與Ⅰ型菌毛末端的細(xì)菌凝集素FimH特異性結(jié)合，作為抗原的遞送載體，介導(dǎo)細(xì)菌抗原進(jìn)入M細(xì)胞，并啟動(dòng)特異性黏膜免疫應(yīng)答[20]。GP2的特異性RNA探針還可用于觀測(cè)M 細(xì)胞靶向的疫苗傳導(dǎo)[42]。本課題組在前期研究中，已經(jīng)對(duì)大腸桿菌FimH的致病性有了較深入的認(rèn)識(shí)[43]，GP2 介導(dǎo)的靶向給藥對(duì)FimH產(chǎn)生的抗菌、抗感染功能，有望成為防控大腸桿菌感染的新方向。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌表達(dá)的外膜蛋白H(outer membrane protein H，OmpH)是C5a受體的配體，給小鼠注射OmpH-綠熒光蛋白偶聯(lián)物能夠誘導(dǎo)特異性IgA產(chǎn)生[44]。表達(dá)在M細(xì)胞頂端表面的補(bǔ)體C5a受體還能與GP2 融合，作為M細(xì)胞靶向疫苗的潛在候選者。因此，進(jìn)一步研究M細(xì)胞介導(dǎo)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的相關(guān)表面受體分子，對(duì)探索更有效的腸黏膜接種方式具有重要意義。

綜上所述，簇狀細(xì)胞和M細(xì)胞在腸黏膜免疫中發(fā)揮著獨(dú)特的功能(表1)，且在腸道疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景，但這兩種IECs在動(dòng)物腸道疾病中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步探索。

表1 腸上皮細(xì)胞的功能[1-27,29-38]

4 小結(jié)與展望

長(zhǎng)期以來(lái)，炎癥性、細(xì)菌性動(dòng)物腸道疾病等一直困擾著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，目前畜禽疾病防控仍以在飼料中添加抗生素為主要手段，然而隨著飼料中禁止添加抗生素相關(guān)條例的落實(shí)，亟需尋找新的防控手段和措施。近年來(lái)，腸道黏膜免疫和腸道菌群的研究引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，而對(duì)處于這兩者關(guān)鍵交界處的IECs及其所參與的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)研究雖在醫(yī)學(xué)界有了一定的進(jìn)展，但在獸醫(yī)領(lǐng)域卻鮮有關(guān)注。

IECs 在腸道黏膜免疫中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，但對(duì)于各種IECs功能及其在宿主和腸道微生物群之間發(fā)揮協(xié)調(diào)作用的確切機(jī)制目前還認(rèn)識(shí)不足?；谏掀ぜ?xì)胞發(fā)展的腸道類器官和疾病模型的相關(guān)研究，也鮮有涉及IECs 與免疫細(xì)胞等周圍基質(zhì)細(xì)胞及腸道微環(huán)境之間復(fù)雜的三界面互作關(guān)系[45]。本研究總結(jié)了各種 IECs 的功能及其與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系，并對(duì)這些細(xì)胞在宿主防御、免疫調(diào)節(jié)以及宿主和微生物代謝方面發(fā)揮的作用進(jìn)行了闡述，旨在為探索預(yù)防和治療動(dòng)物腸道疾病、找尋口服給藥的潛在靶點(diǎn)提供新的切入點(diǎn)和思路。