TNF-α誘導(dǎo)酮病奶牛脂肪組織脂解和胰島素抵抗

范明赫，白洪旭，陳喜瑩，宋玉祥，李心慰，劉國文，王 哲，杜希良，李小兵 (吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

產(chǎn)后奶牛因干物質(zhì)攝入量(DMI)下降但維持泌乳所需的營養(yǎng)物質(zhì)明顯增加，導(dǎo)致嚴重的能量負平衡(NEB)[1]。白色脂肪組織(WAT)作為主要的能量儲存器官，在NEB或營養(yǎng)不良時能分解其存儲的甘油三酯(TAG)提供脂肪酸以確保能量供應(yīng)[2]。強烈和持續(xù)的NEB使脂肪組織過度分解生成大量非酯化脂肪酸(NEFA)。NEFA可被肝臟等組織代謝生成酮體，如β-羥基丁酸(BHBA)，當血液中BHBA的含量超過3 mmol/L時即可診斷為臨床酮病[3]。在美國的集約化牧場中，哺乳早期約有20%以上奶牛檢測患有臨床酮病，而在我國圍產(chǎn)期奶牛臨床酮病患病率更是可高達30%[4-5]。諸多研究表明酮病不但能降低奶牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)，而且能夠增加乳房炎、子宮內(nèi)膜炎和脂肪肝等其他疾病的發(fā)病風險[6]。因此，酮病是圍產(chǎn)期奶牛疾病防控的瓶頸，而脂肪組織過度脂解是酮病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

先前研究發(fā)現(xiàn)酮病奶牛胰島素敏感指數(shù)低于正常奶牛，即出現(xiàn)胰島素抵抗[7]。而脂肪組織是胰島素作用的主要靶器官之一，胰島素抵抗時表現(xiàn)為脂肪分解作用增強和葡萄糖攝入量減少，前者導(dǎo)致NEFA增多進而聚集在肝臟、肌肉等器官，NEFA具有脂毒性，能夠損傷組織器官的胰島素信號通路，進一步引起全身胰島素抵抗并促進酮病的發(fā)生[8]。SETHI等[9]研究表明，小鼠促炎因子水平與脂肪組織的脂解速度呈正相關(guān)，而與機體的胰島素敏感性呈負相關(guān)。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)酮病奶牛血液中促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β和IL-6濃度顯著升高[10]，但這是否與酮病奶牛存在過度脂肪動員以及胰島素敏感性降低有關(guān)尚不清楚。

因此，本研究檢測酮病奶牛脂肪組織脂解水平以及胰島素敏感性變化，并探究炎性因子TNF-α對奶牛脂肪細胞脂解作用和胰島素敏感性的影響，有助于進一步揭示奶牛酮病的發(fā)病機制，為酮病的防治提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

采集奶牛脂肪組織前先剪去尾根部一側(cè)皮膚的5 cm×5 cm區(qū)域被毛并用碘酒和75%酒精消毒，皮下注射2%鹽酸利多卡因麻醉。用手術(shù)刀在皮膚和皮下組織中切開1.5～2.5 cm切口，用無菌鑷子及止血鉗將皮膚拉開，露出組織。使用無菌手術(shù)刀刀片和鑷子取出脂肪組織，用生理鹽水沖洗組織樣品，在液氮中快速冷凍之后，-80℃保存。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素、澳源特級胎牛血清購自Hyclone公司；牛胰島素、地塞米松、IBMX、I型膠原酶購自Sigma公司；p-HSL、ATGL、p-IR、IR、p-Akt、Akt、β-actin抗體購自Abcam和CST公司；紅細胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 血液參數(shù)測定使用Hitachi自動分析儀以及商用試劑盒(NEFA：目錄號FA115；BHB：目錄號RB1008；葡萄糖：目錄號GL3815；Randox Laboratories)測定采集血清中的NEFA、BHB和葡萄糖濃度。

1.4 脂肪細胞的原代分離培養(yǎng)將健康的1日齡荷斯坦奶牛麻醉，在無菌條件下通過外科手術(shù)方法獲取腹膜網(wǎng)膜和腸系膜的脂肪組織。將所得脂肪組織在含有青霉素(2 500 U/mL)和鏈霉素(2 500 mg/L)的無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中沖洗，以去除黏附組織的血液。剝離組織中可見筋膜和血塊，所得組織切成約1 mm2的小塊在37℃下用含膠原酶I型(1 g/L)的DMEM/F12消化液在輕微搖晃的水浴池中消化1.5 h。將消化后的混合物依次通過80和40目濾網(wǎng)，并將濾液在室溫以175×g離心10 min，所得沉淀加入紅細胞裂解液以去除殘留的紅細胞，再以175×g于室溫離心10 min。棄去上清液，并將所得細胞再懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BCM)中，該培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12。細胞計數(shù)后，將細胞懸液濃度調(diào)節(jié)至1×104/cm2，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，于細胞培養(yǎng)箱中37°C、5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)，每48 h更換1次BCM。

為了誘導(dǎo)前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞，將細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)板中。當每孔細胞數(shù)達到70%時，用分化培養(yǎng)基1(DCM1)代替BCM培養(yǎng)用以分化前脂肪細胞，DCM1是終濃度為0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、1 μmol/L地塞米松、和1 mg/L胰島素的BCM。培養(yǎng)48 h后，棄去DCM1，BCM中加入終質(zhì)量濃度為1 mg/L胰島素的分化培養(yǎng)基2(DCM2)代替，維持分化培養(yǎng)，約10 d 細胞內(nèi)出現(xiàn)可見的脂滴，說明細胞已完全分化成熟。

1.5 細胞處理牛TNF-α(ab87904，Abcam)使用含有0.1% BSA的PBS稀釋。經(jīng)誘導(dǎo)成熟的脂肪細胞分別以0、0.1、1.0、10.0 μg/L的TNF-α處理3 h，加入含200 nmol/L胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)液作用15 min，檢測胰島素相關(guān)信號通路。

1.6 蛋白含量檢測和蛋白免疫印跡使用商用蛋白提取試劑盒(C510003，生工生物技術(shù)有限公司)按照說明書從脂肪組織樣本或脂肪細胞中提取蛋白。使用BCA試劑盒(P1511，普利萊有限公司)測定蛋白濃度。

蛋白免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達，具體步驟參考DU等[1]方法。將30 μg的總蛋白質(zhì)以及Marker上樣到12%SDS-PAGE凝膠上，先以80 V 電泳30 min，然后再以120 V電泳45～60 min。電泳完畢后，根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量大小，切取相應(yīng)的膠條，以120 V，45 min將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。之后將PVDF膜放進3% BSA溶液中，在搖床室溫封閉4 h。把封閉后的PVDF膜置于TBST稀釋的一抗溶液中，4℃過夜孵育。一抗孵育后的PVDF膜用TBST洗滌3次，每次6 min。然后將 PVDF 膜放入對應(yīng)的二抗稀釋液中，室溫搖床孵育45 min。二抗孵育后的PVDF膜，TBST洗滌3次，每次6 min。PVDF膜放在顯影儀中，膜上均勻滴涂ECL顯影液，曝光。用Image Pro Plus 6.0進行條帶灰度分析。

1.7 脂肪組織總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增首先取約500 mg脂肪組織在研缽中加液氮研磨至粉狀，研磨好的脂肪組織轉(zhuǎn)移到1.5 mL無RNase的離心管，每管加入1 mL RNAiso Plus(15596026，Thermo公司)，室溫裂解5～10 min后—80℃凍存30 min。取出待溶解后，每管加入200 μL氯仿，上下顛倒使其充分混勻，冰上靜置 5 min后，于4℃下12 000×g離心15 min。此時液體出現(xiàn)分層，吸取上層無色液體，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL無RNase離心管，加入相同體積的異丙醇，輕微混勻，在冰上靜置 10 min后，于4℃下12 000×g離心10 min棄掉上清，管底可見白色RNA沉淀。用DEPC水配置75%的無水乙醇，加1 mL至離心管中，洗滌RNA沉淀后，于4℃下12 000×g離心5 min。棄掉上清，在濾紙上干燥5 min，加入 20～30 μL DEPC水溶解沉淀，用N50型超微量分光光度計檢測RNA濃度。使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)測定的RNA濃度換算出單倍體系所對應(yīng)的總RNA體積，參照說明書進行操作。用實時熒光定量PCR方法檢測TNF-α、IL-1β mRNA的表達水平，引物信息見表1。

張倫對長輩的尊敬還會表現(xiàn)在對待朋友的父母上。有段時間，張倫創(chuàng)業(yè)失敗，他決定騎著摩托車去流浪。途中經(jīng)過朋友老家，想到朋友母親已離世，而朋友久未歸家掃墓，他竟跑到朋友母親墳上祭拜?！鞍尾?、清掃，他說弄了一個下午?！?/p>

表1 PCR引物序列

1.8 甘油(GC)含量測定根據(jù)說明書，使用商用試劑盒(E1002，普利萊有限公司)測定脂肪細胞培養(yǎng)基中的GC含量。收集脂肪細胞培養(yǎng)基，離心后在酶標微版上加入50 μL上清或標準品，再加入150 μL工作液，37℃反應(yīng)10 min。使用酶標儀測定D550值。根據(jù)標準曲線計算GC濃度。

2 結(jié)果

2.1 酮病奶牛血液指標為了探究酮病奶牛的能量代謝狀態(tài)，檢測血液NEFA、BHBA和Glucose含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康奶牛相比，酮病奶牛血清中NEFA和BHBA的濃度更高(P<0.01)，相反，酮病奶牛的血糖濃度更低(P<0.01)(表2)，說明酮病奶牛存在嚴重能量負平衡。

表2 酮病奶牛與健康奶牛血液指標(n=15) mmol/L

2.2 酮病奶牛脂肪組織脂解增強能量負平衡易誘發(fā)脂肪動員，檢測酮病奶牛與健康奶牛體內(nèi)脂肪組織脂解酶的表達，發(fā)現(xiàn)酮病奶牛p-HSL和ATGL的蛋白表達量顯著增高(P<0.01)(圖1A～C),表明酮病奶牛脂肪組織脂解顯著增強。

圖1 Western blot 檢測脂肪組織p-HSL和ATGL的蛋白表達(A)及量化分析(B，C)

2.3 酮病奶牛脂肪組織胰島素敏感性下降前期研究發(fā)現(xiàn)酮病奶牛血液促炎因子濃度增加，能夠引起機體胰島素抵抗。本試驗結(jié)果顯示，酮病奶牛脂肪組織胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白IR和Akt的磷酸化水平顯著降低(P<0.01，P<0.05)(圖2A～C)，表明酮病奶牛脂肪組織胰島素敏感性下降，存在胰島素抵抗。

圖2 Western blot檢測脂肪組織p-IR、IR、p-Akt和Akt的蛋白表達(A)及量化分析(B,C)

2.4 酮病奶牛脂肪組織炎性因子mRNA水平增高炎性通路的過度激活是脂分解和胰島素抵抗的潛在誘因[8-9]。結(jié)果顯示，酮病奶牛脂肪組織TNF-α和IL-1β的mRNA水平升高(P<0.01)，說明脂肪組織炎性反應(yīng)增強，炎性因子表達量增多(圖3A,B)。

圖3 奶牛脂肪組織TNF-α和IL-1β mRNA水平

2.5 TNF-α誘導(dǎo)奶牛脂肪細胞脂解為進一步研究酮病奶牛炎性因子增加對脂肪細胞的影響，在體外培養(yǎng)成熟的奶牛原代脂肪細胞中添加促炎因子TNF-α。結(jié)果顯示，與對照組相比，用TNF-α(0.1、1.0和10.0 μg/L)處理后，p-HSL和ATGL蛋白豐度顯著上升(P<0.01)(圖4A～C)。此外脂肪細胞培養(yǎng)基上清中的GC含量隨著TNF-α的濃度增加而上升(P<0.01，P<0.05)(圖4D)。以上結(jié)果表明，促炎因子TNF-α可以顯著促進脂肪細胞脂解。

圖4 Western blot 檢測TNF-α處理脂肪細胞p-HSL和ATGL的蛋白表達(A)、量化分析(B，C)和培養(yǎng)基中GC含量(D)

2.6 TNF-α誘導(dǎo)奶牛脂肪細胞胰島素敏感性下降檢測TNF-α對脂肪細胞胰島素信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α(0.1、1.0和10.0 μg/L)處理后，p-IR和p-Akt蛋白豐度顯著下降(P<0.01)(圖5A～C)，說明促炎因子TNF-α可以顯著降低奶牛脂肪細胞胰島素敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗。

圖5 Western blot檢測TNF-α處理脂肪細胞p-IR、IR、p-Akt和Akt的蛋白表達(A)及量化分析(B，C)

3 討論

圍產(chǎn)期奶牛能量負平衡誘發(fā)的脂肪動員是酮病發(fā)生的病理學基礎(chǔ)，酮病奶牛常表現(xiàn)為系統(tǒng)性炎癥和胰島素抵抗，但炎性因子能否調(diào)控酮病奶牛脂肪組織的脂解和胰島素敏感性尚未可知。本試驗結(jié)果表明，酮病奶牛脂解酶HSL和ATGL的活性和表達高于正常奶牛，但胰島素敏感性低于正常奶牛且促炎因子TNF-α和IL-1β表達增加；脂肪細胞試驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α引起脂肪細胞的脂解并降低胰島素敏感性。這些結(jié)果說明TNF-α能夠誘導(dǎo)酮病奶牛脂肪組織脂解并降低胰島素敏感性。

臨床酮病奶牛的特點是脂肪組織過度脂解導(dǎo)致血液中高濃度NEFA[11]。在哺乳動物中，ATGL是脂肪分解的第1步與限速步，能將TAG水解為甘油二酯(DAG)并釋放NEFA[11]。敲除ATGL小鼠與正常小鼠相比脂肪分解顯著減少而且脂肪含量增多[12]。在哺乳動物體內(nèi)，HSL也作為脂肪組織關(guān)鍵的水解酶受到可逆的磷酸化作用調(diào)節(jié)，分為有活性(磷酸化)和無活性(非磷酸化)兩種形式[14]?；罨腍SL能將DAG水解為甘油一酯(MAG)同時釋放NEFA[15]。本試驗為了確定酮病奶牛脂肪組織與健康奶牛相比脂解酶的變化情況，采用Western blot檢測p-HSL與ATGL蛋白豐度，結(jié)果顯示酮病奶牛脂肪組織兩種酶的蛋白表達顯著增加，表明酮病奶牛脂肪組織脂解增強并且HSL和ATGL起到關(guān)鍵的促進作用。

先前研究表明由于NEFA和BHBA的脂毒性作用，酮病奶牛和脂肪肝奶牛存在胰島素抵抗，即胰島素敏感組織，如脂肪、肝臟和肌肉，對胰島素的敏感性降低[7]。脂肪細胞是炎性細胞因子的主要來源之一，而炎性因子以及NEFA的增多都將損害PI3K-Akt(磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B)胰島素信號通路正常轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。胰島素受體(IR)屬于受體酪氨酸激酶家族，在脂肪組織中胰島素首先與胰島素受體結(jié)合并使受體磷酸化從而激活下游胰島素信號通路，而胰島素信號通路的任何一步阻滯均會導(dǎo)致胰島素敏感性下降[17]。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，酮病奶牛脂肪組織磷酸化的IR和AKT蛋白豐度下調(diào)，表明酮病奶牛脂肪組織胰島素信號通路阻滯，存在胰島素抵抗。

脂肪組織作為一種活性內(nèi)分泌器官，能夠分泌包括瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α等多種脂肪因子，這些脂肪因子數(shù)量變化影響到包括脂肪組織在內(nèi)的胰島素敏感性及脂質(zhì)代謝[6]。本試驗發(fā)現(xiàn)酮病奶牛脂肪組織中促炎因子TNF-α的mRNA水平顯著增高。在人類脂肪細胞中，TNF-α能夠觸發(fā)脂解釋放NEFA的同時誘發(fā)胰島素抵抗，說明炎癥與脂解、胰島素抵抗之間存在相互聯(lián)系。先前研究曾報道過度脂肪分解產(chǎn)生的脂質(zhì)介體能夠引發(fā)3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗[18]。此外胰島素本身能夠限制脂肪組織脂解，但胰島素抵抗導(dǎo)致的胰島素敏感性下降加劇了脂肪組織進一步脂解，進而促進酮病的發(fā)生和發(fā)展。本試驗通過體外培養(yǎng)奶牛原代脂肪細胞，添加促炎因子TNF-α模擬酮病奶牛體內(nèi)炎性狀態(tài)，結(jié)果顯示TNF-α能夠增加p-HSL與ATGL蛋白豐度和培養(yǎng)基中GC含量，但下調(diào)磷酸化IR和Akt的蛋白豐度，表明TNF-α可能在誘導(dǎo)奶牛脂肪組織脂解與胰島素抵抗中起到重要作用。

綜上所述，酮病奶牛脂肪組織存在過度脂解與胰島素抵抗，并且炎性因子TNF-α能夠誘導(dǎo)脂肪分解并損害胰島素信號通路。因此本試驗有助于進一步了解奶牛酮病發(fā)生的潛在機制，為預(yù)防酮病發(fā)生提供新的思路。