慢性熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛血清酶活性和免疫功能的影響

陳 浩,王純潔,斯木吉德,劉 波,敖日格樂* (.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008;.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008)

應(yīng)激(stress)是機(jī)體對(duì)內(nèi)部或外界各種非常刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和[1]。動(dòng)物在整個(gè)生產(chǎn)周期內(nèi)，不斷遭受著飼養(yǎng)管理、噪聲及溫度等因素造成的應(yīng)激，其中由環(huán)境溫度變化所導(dǎo)致的冷熱應(yīng)激給畜禽生產(chǎn)帶來了極大的危害。奶牛屬恒溫動(dòng)物，其單位體質(zhì)量的散熱面積小而導(dǎo)致皮膚蒸發(fā)散熱困難，且在采食和泌乳等新陳代謝活動(dòng)中產(chǎn)生大量熱量，因此夏季高溫季節(jié)極易引發(fā)奶牛熱應(yīng)激[2]。一般認(rèn)為，當(dāng)環(huán)境溫度超過22℃或溫濕指數(shù)(THI)大于72時(shí)，奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)[3]。史彬林等[4]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氣溫達(dá)到40℃時(shí)，奶牛采食量下降40%。薛白等[5]通過比較不同季節(jié)牛乳質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)與其他3個(gè)季節(jié)相比，夏季牛奶中乳蛋白率和乳脂率均出現(xiàn)不同程度的下降。PEREIRA等[6]報(bào)道，當(dāng)日平均氣溫由33℃上升到41.7℃時(shí)，奶牛的受胎率由61.5%下降到31.0%。

環(huán)境溫、濕度的變化可引起動(dòng)物血液中炎性因子和免疫球蛋白含量改變，降低動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞和體液免疫功能，奶牛血清中促炎因子的升高與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[7]。據(jù)研究報(bào)道指出，熱應(yīng)激可顯著降低奶牛血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量，并顯著降低初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量[8-9]。張秩鳳[10]研究發(fā)現(xiàn)，與春季非應(yīng)激狀態(tài)相比，夏季高溫、高濕環(huán)境下奶牛血清中IgG含量極顯著下降，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量極顯著升高。

目前關(guān)于反芻動(dòng)物熱應(yīng)激的研究報(bào)道主要集中于我國南方高溫、高濕條件下熱應(yīng)激對(duì)反芻動(dòng)物的影響。然而近年來的研究結(jié)果表明，根據(jù)綜合指數(shù)(CCI)回歸公式判定，呼和浩特市和北京市奶牛全年至少分別有144和131 d處于熱應(yīng)激狀態(tài)[11-12]。此外，目前關(guān)于夏季高溫對(duì)內(nèi)蒙古草原放牧西門塔爾牛的影響相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究擬以放牧條件下西門塔爾母牛為試驗(yàn)群體，檢測(cè)試驗(yàn)個(gè)體在熱應(yīng)激與非應(yīng)激狀態(tài)下的免疫指標(biāo)和血清酶活性的差異，探討慢性熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛免疫功能和血清酶活性的影響，篩選可判別熱應(yīng)激反應(yīng)的血液生化指標(biāo)，旨在為肉?？篃釕?yīng)激研究及當(dāng)?shù)睾Y選抗熱應(yīng)激個(gè)體提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理本試驗(yàn)在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)奧科斯牛場(chǎng)進(jìn)行，以牧場(chǎng)提供的16頭體況健康、體質(zhì)量相近的西門塔爾母牛為研究對(duì)象。全部試驗(yàn)牛均在同一天然草場(chǎng)自然放牧(牧草營養(yǎng)成分見表1)，自由飲水(草場(chǎng)內(nèi)有天然河流)。試驗(yàn)分為熱應(yīng)激期(2018年7月16日—7月20日)和非應(yīng)激期(2018年8月26日—8月30日)兩個(gè)階段進(jìn)行。

1.2 CCI測(cè)定本試驗(yàn)以天然草場(chǎng)自然放牧的肉牛為研究對(duì)象，根據(jù)當(dāng)?shù)貧庀筚Y料記錄的溫度、相對(duì)濕度和風(fēng)速，記錄日照時(shí)間并根據(jù)MADER等[13]提出的計(jì)算公式計(jì)算牧場(chǎng)的CCI。

1.3 血清制備和血液生化指標(biāo)測(cè)定在各試驗(yàn)期最后1 d清晨出牧前，每頭試驗(yàn)牛頸靜脈采血10 mL，室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液分裝至1.5 mL離心管中，分離出的血清立即置于液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存供測(cè)定血清生化指標(biāo)。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、TNF-α、IgA、IgG、IgM、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測(cè)定過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 牧草營養(yǎng)成分和CCI測(cè)定結(jié)果綜合溫濕度、風(fēng)速和日照時(shí)間的CCI是判斷肉牛熱應(yīng)激的最準(zhǔn)確的指數(shù)之一。以CCI作為熱應(yīng)激的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)CCI>25時(shí)牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。通過對(duì)放牧草場(chǎng)溫、濕度和CCI的測(cè)定，結(jié)果顯示在試驗(yàn)第1階段草場(chǎng)最高溫度達(dá)到40.50℃，CCI在此期間平均高達(dá)29.61，表明此階段的西門塔爾牛遭受熱應(yīng)激侵襲(表2)；而非應(yīng)激期的平均溫度為22.82℃，CCI為20.37,均未達(dá)到肉牛產(chǎn)生熱應(yīng)激的臨界值；表1結(jié)果顯示試驗(yàn)期間牧草營養(yǎng)成分無顯著變化，符合試驗(yàn)要求，可以進(jìn)行下一步西門塔爾牛免疫及抗氧化功能比較研究試驗(yàn)。

表1 放牧草場(chǎng)牧草概略養(yǎng)分(干物質(zhì)基礎(chǔ)) %

表2 不同試驗(yàn)期草場(chǎng)溫、濕度及CCI

2.2 西門塔爾牛免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果慢性熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛免疫指標(biāo)影響的測(cè)定結(jié)果見表3。與非應(yīng)激狀態(tài)相比，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，試驗(yàn)牛血清中IL-2、IgA及IgG含量均顯著下降(P<0.05)，TNF-α和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，但I(xiàn)L-4和IgM含量無顯著性差異(P>0.05)。

表3 西門塔爾牛血清免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 ng/L

2.3 西門塔爾牛血清酶活性測(cè)定結(jié)果慢性熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛血清酶活性影響的測(cè)定結(jié)果見表4。與非應(yīng)激狀態(tài)相比，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，試驗(yàn)牛血清中CK、LDH、ALT及AST含量顯著升高(P<0.05)，但AKP含量無顯著變化(P>0.05)。

表4 西門塔爾牛血清酶活性測(cè)定結(jié)果 U/L

3 討 論

3.1 慢性熱應(yīng)激的判定及其對(duì)西門塔爾牛免疫功能影響奶牛在夏季高溫季節(jié)極易遭受熱應(yīng)激侵襲，MADER等[3]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境溫度超過22℃時(shí)，奶牛即出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，徐明等[11]通過研究呼和浩特地區(qū)奶牛熱應(yīng)激判定，也得出同樣結(jié)論。THI綜合環(huán)境溫度和相對(duì)濕度，常用于判定奶牛遭受熱應(yīng)激程度。INGRAHAM等[14]報(bào)道當(dāng)THI處于72～78時(shí)，奶牛處于輕度熱應(yīng)激狀態(tài)；當(dāng)THI為79～89時(shí)，奶牛將出現(xiàn)中度熱應(yīng)激反應(yīng)；當(dāng)THI大于90時(shí)，將出現(xiàn)重度熱應(yīng)激反應(yīng)，極有可能導(dǎo)致奶牛死亡。奶牛活動(dòng)最適宜的溫度范圍為-0.5～20.0℃，肉牛生長適宜溫度是5～25℃[15-16]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)后期草場(chǎng)平均溫度為22.82℃，CCI為20.37，沒有達(dá)到牛產(chǎn)生熱應(yīng)激的臨界值，因此試驗(yàn)牛在試驗(yàn)后期處于非應(yīng)激狀態(tài)；試驗(yàn)前期牛舍內(nèi)平均溫度為33.59℃，CCI達(dá)到29.61，已超出牛產(chǎn)生熱應(yīng)激的臨界值，試驗(yàn)牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫分子和免疫細(xì)胞組成，免疫分子包括免疫球蛋白、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和干擾素等，機(jī)體可通過血液循環(huán)將免疫分子運(yùn)送到全身，執(zhí)行免疫防御和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能。IL-2是T淋巴細(xì)胞受抗原刺激時(shí)分泌的淋巴因子；IL-1β、TNF-α和IL-4作為促炎癥因子，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，其濃度的升高和奶牛炎癥反應(yīng)有極大的相關(guān)性，且前者可調(diào)節(jié)多種免疫系統(tǒng)反應(yīng)[17-19]。免疫球蛋白是一類具有抗體活性的球蛋白，是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分，IgA、IgG和IgM可在機(jī)體特異性免疫中發(fā)揮重要作用[20]。WU等[21]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)免疫球蛋白含量的高低可能取決于應(yīng)激強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間以及動(dòng)物品種和體況。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，不同持續(xù)時(shí)間的熱應(yīng)激均可導(dǎo)致山羊血清中IgA、IgG和IgM含量顯著降低，這表明在高溫環(huán)境下，山羊機(jī)體的免疫功能受到抑制，嚴(yán)重?fù)p害其體液免疫[22-23]。同樣熱應(yīng)激可使肉牛血清中IgG含量顯著下降[24]。IgG是免疫球蛋白的主要成分，約占血清中免疫球蛋白總濃度的75%，其含量的高低可體現(xiàn)機(jī)體體液免疫的狀況[25]。CARROLL等[26]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)下，安格斯牛血液中的TNF-α升高，熱應(yīng)激可導(dǎo)致肉牛發(fā)生炎癥反應(yīng)。PELI等[27]報(bào)道夏季熱應(yīng)激后導(dǎo)致犢牛血清中IL-4含量由3.3 ng/L顯著上升到7.4 ng/L。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾牛血清中IL-1β、IL-2和TNF-α含量顯著高于于非應(yīng)激期，表明持續(xù)熱應(yīng)激導(dǎo)致西門塔爾牛發(fā)生了炎癥反應(yīng)。熱應(yīng)激條件下西門塔爾牛血清中IgA和IgG含量顯著低于非應(yīng)激期，表明西門塔爾牛在夏季遭受持續(xù)高溫刺激，導(dǎo)致其機(jī)體的免疫組織和功能遭到損害，體液免疫受到抑制。

3.2 慢性熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛血清酶活性的影響血清中的酶大部分來自機(jī)體的組織器官，酶是調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體新陳代謝的催化劑，動(dòng)物在健康生理狀況時(shí)，由于細(xì)胞膜的屏障作用，細(xì)胞內(nèi)的酶不易逸出，當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損傷時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的酶釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中酶含量增多，因此血清酶活性可作為判定動(dòng)物組織器官健康狀況和應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[28]。AKP廣泛的存在于動(dòng)物體內(nèi)的肝、胰等組織器官中；ALT和AST是機(jī)體氨基酸代謝過程中的兩種重要的轉(zhuǎn)移酶，主要存在于肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)會(huì)逸出到血液中；LDH主要存在于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)液中，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體組織發(fā)生病變時(shí)，機(jī)體的糖代謝過程由有氧氧化轉(zhuǎn)化為無氧酵解時(shí)，血液中LDH活性增加[29]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，與機(jī)體內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)和ATP再生有密切關(guān)系，且其含量的高低可反應(yīng)應(yīng)激對(duì)機(jī)體內(nèi)組織細(xì)胞的損傷程度[30]。何欽[31]研究表明，在熱應(yīng)激條件下，不同泌乳階段奶牛血清CK活性均出現(xiàn)不同程度的升高，且隨著熱應(yīng)激程度的增加，各泌乳階段奶牛血清CK活性均有升高趨勢(shì)。劉慶華等[32]報(bào)道熱應(yīng)激狀態(tài)下，荷斯坦奶牛和娟—荷奶牛血清中AKP、AST及ALT活性均顯著升高。但蔡明成[33]通過熱應(yīng)激對(duì)肉牛血清酶活性研究，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激對(duì)肉牛血清AST和ALT活性無顯著影響，可能因?yàn)檠迕富钚杂啥喾N途徑調(diào)控。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激期間西門塔爾牛血清中CK、AST和ALT活性顯著高于非應(yīng)激期，這表明高溫引起的熱應(yīng)激對(duì)西門塔爾牛肝臟造成了一定的損傷，且對(duì)其組織細(xì)胞的供能造成了一定的影響。此外，熱應(yīng)激導(dǎo)致西門塔爾牛血清中LDH活性顯著升高，可能某些組織器官已發(fā)生病變，機(jī)體能量代謝受到限制，但具體作用過程還需進(jìn)一步探討研究。本試驗(yàn)條件下，慢性熱應(yīng)激可造成放牧西門塔爾母牛免疫功能下降，導(dǎo)致其患病風(fēng)險(xiǎn)升高。