奶牛產(chǎn)后血液炎性因子變化規(guī)律

郭啟勇,陶金忠,吳心華,郭延生 (寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

奶牛圍產(chǎn)期(periparturient period)指產(chǎn)前21 d和產(chǎn)后21 d[1]，這一時期奶牛經(jīng)歷了妊娠-產(chǎn)犢-泌乳3個巨大的生理變化。產(chǎn)后由于食欲尚未恢復(fù)，加之泌乳啟動，能量攝入遠(yuǎn)低于能量輸出，所以奶牛分娩后易處于能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)的生理狀態(tài)。NEB導(dǎo)致血糖水平降低，并動員分解體脂以彌補(bǔ)能量不足，血液中游離脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸(BHBA)濃度反饋性升高[2]。而高濃度的NEFA與BHBA使免疫機(jī)能受到抑制，使機(jī)體對病原微生物的易感性增加[3]。據(jù)報道，NEFA含量與慢性炎癥的發(fā)生有關(guān)，隨著NEFA增加，炎癥反應(yīng)逐漸加重，單核細(xì)胞吞噬細(xì)菌碎片和中性粒細(xì)胞抗擊細(xì)菌侵襲能力也在降低[4]。

細(xì)胞因子主要由T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生。其功能包括激活和抑制免疫系統(tǒng)反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和調(diào)節(jié)記憶細(xì)胞[5]。以往大多數(shù)研究僅集中在奶牛產(chǎn)后發(fā)生炎性疾病(如子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下和乳房炎)時一些炎性細(xì)胞因子的變化情況，對產(chǎn)后21 d內(nèi)炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律缺乏系統(tǒng)研究。因此本研究對奶牛產(chǎn)后21 d內(nèi)炎性細(xì)胞因子的動態(tài)變化進(jìn)行研究，以期揭示奶牛圍產(chǎn)后期炎性應(yīng)答的基本規(guī)律，為預(yù)防產(chǎn)后炎性疾病的發(fā)生提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理實(shí)驗(yàn)動物均為荷斯坦奶牛，牛只飼喂和樣品采集均于2019年9月至11月在寧夏某規(guī)?；B(yǎng)殖場進(jìn)行。選取體況相近的2～3胎次自然分娩的產(chǎn)后荷斯坦奶牛10頭。奶牛場每天擠奶3次(4:00、12:00、20:00)。采用全混合日糧(TMR)飼喂，自由飲水，產(chǎn)前使用表1配方飼喂，產(chǎn)后用表2配方飼喂。產(chǎn)后1 h內(nèi)將益康XP 350 g、丙酸鈣450 g、硫酸鎂100 g、鹽50 g、丙二醇300 mL、氯化鈣120 g和20 L溫水混合經(jīng)瘤胃導(dǎo)管灌服。

表1 圍產(chǎn)前期奶牛TMR日糧配方 %

表2 奶牛產(chǎn)后TMR日糧配方 %

1.2 樣品采集在分娩后0、7、14和21 d早上飼喂前尾靜脈采集血液10 mL，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，-196℃保存待測。

1.3 主要試劑分別利用牛腫瘤壞死因子(TNF-α)、牛白細(xì)胞介素1(IL-1)、牛白細(xì)胞介素2(IL-2)、牛白細(xì)胞介素6(IL-6)、牛白細(xì)胞介素8(IL-8)、牛白細(xì)胞介素17(IL-17)、牛白細(xì)胞介素18(IL-18)、牛白細(xì)胞介素23(IL-23)、牛轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、牛白細(xì)胞介素4(IL-4)、牛白細(xì)胞介素10(IL-10)、牛白細(xì)胞介素13(IL-13)和牛免疫球蛋白(IgG)試劑盒進(jìn)行檢測(江蘇晶美，中國)。

1.4 試驗(yàn)方法血樣常溫下解凍，采用ELISA法對血漿中TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IL-23、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13和IgG含量進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 奶牛產(chǎn)后促炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律血漿中TNF-α、IL-8、IL-17的含量在產(chǎn)后0 d顯著高于產(chǎn)后7、14和21 d(P<0.05)；血漿中IL-1的含量在產(chǎn)后14 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中IL-2、IL-18的含量在產(chǎn)后0 d極顯著高于產(chǎn)后其他時間段(P<0.01)；血漿中IL-6含量在產(chǎn)后7 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中IL-23含量在產(chǎn)后0 d顯著低于其他時間段(P<0.05)，且隨著時間逐漸升高且差異顯著(P<0.05)；血漿中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18的含量在產(chǎn)后21 d顯著降低(P<0.05)(表3，圖1)。

表3 奶牛產(chǎn)后不同時間促炎性細(xì)胞因子的變化 ng/L

A.奶牛產(chǎn)后血漿中TNF-α和IL-1質(zhì)量濃度；B.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-2質(zhì)量濃度；C.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-6和IL-8質(zhì)量濃度;D.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-17和IL-23質(zhì)量濃度;E.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-18質(zhì)量濃度。**表示差異極顯著(P<0.01);*表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 奶牛產(chǎn)后抗炎性細(xì)胞因子變化規(guī)律血漿中TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13和IgG的含量在產(chǎn)后0 d顯著高于其他時間段(P<0.05)；血漿中IL-4的含量在產(chǎn)后7 d開始逐漸下降且差異不顯著(P>0.05)；血漿中TGF-β、IL-10和IL-13的含量在產(chǎn)后21 d顯著低于其他時間段(P<0.05)(表4，圖2)。

表4 奶牛產(chǎn)后不同時間抗炎性細(xì)胞因子變化 ng/L

A.奶牛產(chǎn)后血漿中TGF-β和IL-10質(zhì)量濃度;B.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-13和IgG質(zhì)量濃度；C.奶牛產(chǎn)后血漿中IL-14質(zhì)量濃度

3 討論

3.1 奶牛產(chǎn)后促炎性細(xì)胞因子的變化規(guī)律促炎性因子的釋放將會導(dǎo)致免疫細(xì)胞的激活和產(chǎn)生。TNF-α可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另有研究表明，產(chǎn)前7 d給奶牛每天皮下注射TNF-α，血漿TNF-α含量增加3倍，奶牛干物質(zhì)采食量(dry matter intake,DMI)降低24%[6]，說明血漿中的TNF-α含量的升高對奶牛DMI有抑制作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后0 d TNF-α含量極顯著高于產(chǎn)后7、14和21 d，這與產(chǎn)犢造成的子宮炎性損傷密切相關(guān)，而TNF-α的升高又進(jìn)一步抑制了奶牛DMI。

IL-1的表達(dá)對炎癥具有多效性作用，作為一種主要的促炎細(xì)胞因子，IL-1主要由天然免疫細(xì)胞表達(dá)。然而，在生理和病理?xiàng)l件下，各種類型的細(xì)胞都表達(dá)IL-1，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過不同水平的正負(fù)調(diào)控因子對免疫機(jī)能進(jìn)行調(diào)控[7]。另外，在細(xì)菌感染時，通過中性粒細(xì)胞特異性蛋白酶在中性粒細(xì)胞的表達(dá)促使IL-1含量增高。在本研究中，產(chǎn)后14 d血漿中IL-1的含量顯著高于其他時間段，這說明產(chǎn)后14 d是代謝性疾病和感染性疾病最為容易發(fā)生的時間。另外也有調(diào)查研究顯示，奶牛產(chǎn)后14 d是疾病高發(fā)時期[8]。

IL-2的主要生理作用是刺激和維持T淋巴細(xì)胞的分化增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化過程中各亞型淋巴細(xì)胞的活化，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。IL-2具有調(diào)節(jié)CD4+和CD8+細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞增殖、促進(jìn)抗體產(chǎn)生和B淋巴細(xì)胞增殖[9]的作用。IL-2的變化與產(chǎn)后時間的延長沒有直接關(guān)系，與特異性受體的親和力有關(guān)[10]。有研究表示IL-2對妊娠有消極作用，在懷孕小鼠的體內(nèi)注射IL-2，可使懷孕小鼠終止妊娠[11]，IL-6可作為急性感染的早期診斷依據(jù)，細(xì)菌感染后IL-6含量迅速升高，其升高水平與感染的嚴(yán)重程度一致。有研究表明，正常泌乳期奶牛血漿中IL-1和IL-6的含量比早期泌乳期低1.5～5.0倍[12]。IL-8是炎癥反應(yīng)和血管生成重要的趨化因子，在腫瘤細(xì)胞系、癌癥患者的血液中含量均升高，由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。奶牛產(chǎn)后0 d血漿中IL-2、IL-6和IL-8濃度升高，這與奶牛分娩啟動導(dǎo)致的產(chǎn)道和子宮損傷有關(guān)。產(chǎn)后7 d，血漿中IL-2、IL-6和IL-8濃度沒有顯著降低，這可能與產(chǎn)后7 d病原微生物的侵襲有關(guān)。另外也有研究表明，奶牛發(fā)生炎癥反應(yīng)或病原微生物的感染會使血漿中IL-2、IL-6和IL-8濃度升高[13-14]。

IL-17誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞生成和遷移，是黏膜免疫最為主要的細(xì)胞因子，黏膜免疫的缺陷有助于細(xì)菌和病毒入侵，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奶牛產(chǎn)后0 d血漿中IL-17的含量顯著高于其他時間段，這可能與產(chǎn)后0 d產(chǎn)道的急性損傷和分娩啟動有關(guān)。另外有研究表明，當(dāng)奶牛被牛病毒性腹瀉病毒和金黃色葡萄球菌感染時，血漿中的IL-17也顯著升高[15-16]。IL-18是IL-1細(xì)胞因子家族的一員，是胃腸道黏膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有促炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。相關(guān)資料顯示IL-18濃度的升高與分娩啟動有關(guān)[17]。在本研究中，產(chǎn)后0 d血漿中IL-18極顯著高于產(chǎn)后其他階段，這可能與分娩啟動有關(guān)。

IL-23是一種中樞促炎細(xì)胞因子，對免疫反應(yīng)具有廣泛的影響。IL-12和IL-23在結(jié)構(gòu)上共享同一個亞基，并在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞應(yīng)對外界病原微生物產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子[18]。IL-23在感染、炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用，人醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)腸炎和銀屑病患者的IL-23的水平較高[19]。本研究中血漿中的IL-23含量在產(chǎn)后不斷升高且產(chǎn)后21 d顯著高于其他階段，這可能與產(chǎn)后NEB造成的免疫抑制和產(chǎn)后酸中毒導(dǎo)致的腹瀉密切相關(guān)。

3.2 奶牛產(chǎn)后抗炎性細(xì)胞因子變化規(guī)律抗炎性細(xì)胞因子表達(dá)是機(jī)體自我防御的體現(xiàn)，奶牛產(chǎn)后由于生產(chǎn)應(yīng)激和泌乳需要，導(dǎo)致抗炎性細(xì)胞因子的含量升高。TGF-β是一種主要的免疫抑制細(xì)胞因子，所有免疫系統(tǒng)細(xì)胞都表達(dá)TGF-β，TGF-β是最強(qiáng)大的免疫抑制細(xì)胞因子，在各種免疫細(xì)胞中的抗增殖和抗炎來維持免疫穩(wěn)態(tài)[20]。另有研究表明，當(dāng)奶?；甲訉m內(nèi)膜炎時，血液中TGF-β的含量顯著低于健康奶牛[21]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，產(chǎn)后0 d血漿中TGF-β含量顯著高于產(chǎn)后7、14和21 d，產(chǎn)后7和14 d明顯高于產(chǎn)后21 d。這說明奶牛產(chǎn)后由于分娩啟動和NEB，造成奶牛在圍產(chǎn)后期處于免疫抑制狀態(tài)。IL-10是炎癥和傷口愈合中的主要抗炎因子和抗纖維化因子，是一種有效的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，主要作用是抑制樹突狀細(xì)胞的抗原遞呈,抑制巨噬細(xì)胞的活化和浸潤到損傷部位，繼而減弱促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[22]。從細(xì)胞水平上來說，IL-10是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子來限制損傷后的組織死亡和器官功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，由于產(chǎn)犢造成的出血使產(chǎn)后0 d奶牛血漿中IL-10的含量顯著高于其他階段。產(chǎn)后7、14和21 d逐漸降低，這與機(jī)體的產(chǎn)后能量負(fù)平衡的恢復(fù)有關(guān)。

IL-4和IL-13享用同一受體鏈和信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，因此IL-4和IL-13功能有部分重疊，兩者均具有支持B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的作用[23]，IL-4和IL-13共享受體和生物活性的可用性反映了免疫保護(hù)在進(jìn)化上的作用，兩者都會影響組織結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)和正常皮膚屏障保護(hù)，IL-13還參與皮膚炎癥反應(yīng)。IL-13在外周免疫機(jī)能中的作用更為突出，在炎性反應(yīng)狀態(tài)下，IL-13會迅速升高[24]。研究表明，懷孕期間血漿中IL-4含量上升，IL-4是一種很重要的抗病毒免疫細(xì)胞，可以促進(jìn)白細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，以及抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化[25]。IL-4的含量降低，革蘭陽性金黃色葡萄球菌的傳播概率就會增大[26]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，IL-4和IL-13含量也呈現(xiàn)類似的變化，產(chǎn)后0 d顯著高于產(chǎn)后其他時間段，產(chǎn)后7、14和21 d差異不顯著。這說明奶牛產(chǎn)后抗病毒和阻止細(xì)菌感染的能力明顯降低。IgG是血清主要的抗體成分，也是唯一可以通過胎盤的免疫球蛋白。臨床上通過對IgG的檢測來評價初生犢牛的獲得性免疫，IgG在初乳中的含量比常乳高，牛布魯菌的免疫效果使用IgG來評價。本次研究中血漿中IgG在產(chǎn)后0 d顯著升高，產(chǎn)后7 d開始逐漸降低，說明分娩啟動和產(chǎn)后能量負(fù)平衡會導(dǎo)致IgG的升高，但是隨著機(jī)體的逐漸恢復(fù)，IgG的濃度逐漸降低。

本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了奶牛在產(chǎn)后0、7、14和21 d血液中細(xì)胞因子的變化規(guī)律，結(jié)果顯示奶牛產(chǎn)后0 d血漿中TNF-α、IL-2、IL-8、IL-17、IL-18、TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13和IgG的含量高于其他時間段，IL-1的含量在產(chǎn)后14 d高于其他時間段，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、TGF-β、IL-10和IL-13的含量在產(chǎn)后21 d顯著降低，IL-6含量在產(chǎn)后7 d高于其他時間段，IL-23含量在產(chǎn)后0 d低于其他時間段，且隨著時間逐漸升高，IL-4的含量在產(chǎn)后7 d開始逐漸下降。這說明奶牛產(chǎn)后炎性因子的變化可能與分娩啟動、急性炎性損傷和能量負(fù)平衡引起的免疫抑制和病原微生物的感染等多種因素有關(guān)。