豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)雙重巢式PCR檢測(cè)方法的建立

王朋林，陳凱麗，鄭 玲，劉林科，王榮軍，張龍現(xiàn)，寧長(zhǎng)申，菅復(fù)春 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬囊孢球蟲(chóng)(Cystoisosporasuis)原名豬等孢球蟲(chóng)(Isosporasuis)，歸類(lèi)于真球蟲(chóng)目(Eucoccidiorida)、肉孢子球蟲(chóng)科(Sarcosporidae)、囊等孢球蟲(chóng)屬(Cystoisospora)。豬囊孢球蟲(chóng)可感染不同品種和不同年齡階段的豬，尤其對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，臨床癥狀可表現(xiàn)為非出血性腹瀉[1]，治療不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致僵豬或死亡，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。畢氏腸微孢子蟲(chóng)(Enterocytozoonbieneusi)是一種可感染人和多種動(dòng)物胃腸道的人獸共患病原。1985年首次在艾滋病(HIV)患者中發(fā)現(xiàn)[2]。一般情況下，感染此病原后免疫功能正常的機(jī)體無(wú)明顯的臨床癥狀，但對(duì)HIV患者和免疫功能低下的兒童會(huì)造成持續(xù)性腹瀉并伴有發(fā)熱、食欲下降和體質(zhì)量減輕等癥狀[3]。此外，畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染宿主廣泛，如非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(NHP)、反芻動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等，并對(duì)它們的胃腸道造成嚴(yán)重?fù)p傷，因此引起世界各國(guó)研究者的高度關(guān)注[4]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)的PCR檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種腸道原蟲(chóng)的分子流行病學(xué)調(diào)查[5-7]。目前尚無(wú)關(guān)于豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)的雙重nest-PCR方法，本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、可同時(shí)診斷豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)的雙重nest-PCR方法，以期能快速鑒定兩種病原，為豬腸道原蟲(chóng)病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病原豬囊孢球蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)均由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定;大腸桿菌菌株由本院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 試劑KOD plus DNA聚合酶、TAE緩沖液、瓊脂糖、雙蒸水、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa有限公司；E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA有限公司。

1.3 引物合成使用DNAStar等工具對(duì)2對(duì)nest-PCR引物兼容性進(jìn)行檢測(cè)，避免各組引物間形成二聚體。2對(duì)引物均由上海生物工程公司合成。

表1 雙重nest-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.4 DNA 模板的制備取待檢豬的陽(yáng)性糞便20～50 g，置滅菌燒杯充分?jǐn)噭?，稱(chēng)取攪拌后的糞便樣本180～220 mg至1.5 mL離心管中，按E.Z.N.A.?D4015-02糞便全基因組DNA提取試劑盒提取說(shuō)明書(shū)提取模板DNA。

1.5 雙重nest-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化在豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)單病原檢測(cè)nest-PCR檢測(cè)方法穩(wěn)定反應(yīng)的基礎(chǔ)上，將豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)的DNA等量混勻物作為模板，對(duì)雙重nest-PCR中的引物比、Buffer、dNTPs、酶、Tm值、循環(huán)數(shù)等各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選雙重nest-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和條件。

1.6 特異性試驗(yàn)將分別用傳統(tǒng)鏡檢及nest-PCR鑒定后確定的豬囊孢球蟲(chóng)與畢氏腸微孢子蟲(chóng)混合物、豬囊孢球蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)和大腸桿菌等DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物用于1 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7 敏感性試驗(yàn)使用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)分別測(cè)量豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。豬囊孢球蟲(chóng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的原始質(zhì)量濃度為209 mg/L(D260/D280=1.86)，畢氏腸微孢子蟲(chóng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的原始質(zhì)量濃度為527 mg/L(D260/D280=1.84)，D260/D280=1.80～2.00時(shí)，證明核酸純度較好。分別將兩種病原的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋(豬囊孢球蟲(chóng)：209～209×10-8mg/L；畢氏腸微孢子蟲(chóng)：527～527×10-8mg/L)后作為模板，進(jìn)行豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)雙重nest-PCR方法的敏感性試驗(yàn)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)使用建立的雙重nest-PCR方法隨機(jī)選擇3個(gè)混合感染豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)DNA樣品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，以保證該方法對(duì)豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)檢測(cè)的穩(wěn)定性與可行性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)用本試驗(yàn)建立的雙重nest-PCR方法對(duì)采自河南信陽(yáng)的48份豬糞便DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，并與豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)的單病原nest-PCR方法進(jìn)行比較。檢測(cè)結(jié)果通過(guò)雙向測(cè)序，對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析以排除假陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 雙重nest-PCR引物比優(yōu)化結(jié)果將畢氏腸微孢子蟲(chóng)和豬囊孢球蟲(chóng)引物比分別按照1.00∶0.25、1.00∶0.50、1.00∶0.75、1.00∶1.00進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示畢氏腸微孢子蟲(chóng)和豬囊孢球蟲(chóng)的引物量的比為1.0∶0.25時(shí)有穩(wěn)定雙條帶出現(xiàn)。圖1為3個(gè)不同的畢氏腸微孢子蟲(chóng)和豬囊孢球蟲(chóng)DNA混合物在兩者引物量比為1.00∶0.25時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.畢氏腸微孢子蟲(chóng)和豬囊孢球蟲(chóng)DNA混合物；4.陰性對(duì)照

2.2 雙重nest-PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果結(jié)果顯示，雙重nest-PCR在50～60℃范圍內(nèi)擴(kuò)增效率變化不大，由于豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)單重nest-PCR 2次擴(kuò)增的退火溫度分別為57和55℃，因此本試驗(yàn)選擇將第1輪、第2輪退火溫度分別確定為57、55℃(圖2、3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.分別為60.0、59.2、58.0、57.0、56.1、53.8、51.9、50.7、50.0℃；10.陰性對(duì)照

2.3 雙重nest-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)混合物、豬囊孢球蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)均擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶，而安氏隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)、大腸桿菌均未擴(kuò)增出特征性條帶，證明本試驗(yàn)特異性良好(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.微孢子蟲(chóng)+豬囊孢球蟲(chóng)、豬囊孢球蟲(chóng)、微孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)、芽囊原蟲(chóng)、E.coli;8.陰性對(duì)照

2.4 雙重nest-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果按照已優(yōu)化的反應(yīng)條件及體系進(jìn)行雙重nest-PCR敏感性試驗(yàn)，DNA模板與豬囊孢球蟲(chóng)、畢氏腸微孢子蟲(chóng)單病原nest-PCR試驗(yàn)相同。結(jié)果顯示，豬囊孢球蟲(chóng)的最低檢測(cè)限為209×10-5mg/L，畢氏腸微孢子蟲(chóng)的最低檢測(cè)限為527×10-7mg/L(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.分別為2種病原質(zhì)粒10倍倍比稀釋100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8；10.陰性對(duì)照；6.209×10-5 μg/L;8.527×10-7 μg/L

2.5 雙重nest-PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用建立的雙重nest-PCR方法隨機(jī)選擇3個(gè)豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)的陽(yáng)性DNA樣品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示，雙重nest-PCR方法檢測(cè)豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.樣品；4.陰性對(duì)照

2.6 雙重nest-PCR臨床樣品檢測(cè)用本試驗(yàn)建立的豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)雙重nest-PCR方法對(duì)采自信陽(yáng)的48份豬糞便DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，單病原nest-PCR擴(kuò)增豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性率分別為12.50%(6/48)和22.92%(11/48)，混合感染陽(yáng)性率為4.17%(2/48)；雙重nest-PCR豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性率分別為20.83%(10/48)和8.33%(4/48)，混合感染陽(yáng)性率為4.17%(2/48)；單重nest-PCR和雙重nest-PCR檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明建立的雙重nest-PCR可用于臨床檢測(cè)。

表2 單重nest-PCR和雙重nest-PCR對(duì)豬臨床糞便樣品檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

多重nest-PCR反應(yīng)是在同一反應(yīng)體系中，同時(shí)加入多個(gè)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，但多對(duì)引物之間的配比、相互競(jìng)爭(zhēng)及抑制等均會(huì)影響多重nest-PCR的擴(kuò)增結(jié)果[8]，因此，篩選合適的引物并調(diào)整最佳引物配比，是保證試驗(yàn)順利進(jìn)行的基本要素。此外，合適的多重nest-PCR引物不但要求能特異和敏感地?cái)U(kuò)增出目的條帶，各引物間還要有相近的退火溫度和循環(huán)數(shù)。本試驗(yàn)所選擇的2對(duì)引物，其GC%含量和Tm值相近，為豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)均能得到良好的擴(kuò)增以及雙重nest-PCR方法的建立奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)初期進(jìn)行雙重nest-PCR反應(yīng)時(shí)，將豬囊孢球蟲(chóng)和畢氏腸微孢子蟲(chóng)引物按等量加入，同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)特異性基因時(shí)，豬囊孢球蟲(chóng)的擴(kuò)增效率高于畢氏腸微孢子蟲(chóng)的擴(kuò)增效率。因此，可通過(guò)調(diào)整加入的引物量比來(lái)實(shí)現(xiàn)使各引物的擴(kuò)增效率相近的產(chǎn)物[9]。

豬囊孢球蟲(chóng)單病原nest-PCR的敏感度為209×10-6mg/L，敏感性比雙重nest-PCR高10倍；畢氏腸微孢子蟲(chóng)單病原nest-PCR最低檢測(cè)限限為527×10-9mg/L，與雙重nest-PCR敏感性相比高100倍，這與彭武麗等[10]報(bào)道的單PCR敏感性高于多重PCR敏感性一致，但處于可接受水平。造成此敏感性差異的原因眾多，比如引物之間的互作和反應(yīng)參數(shù)的差異等。本研究同時(shí)使用單nest-PCR方法和建立的雙重nest-PCR方法對(duì)采自信陽(yáng)的48份糞便DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，單nest-PCR的檢出率略高于雙重nest-PCR，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單nest-PCR和雙重nest-PCR檢測(cè)結(jié)果差異并不顯著(P>0.05)。這一結(jié)論與MORIO等[11]對(duì)首個(gè)商業(yè)化檢測(cè)糞樣中的隱孢子蟲(chóng)、腸畢氏微孢子蟲(chóng)和腸腦炎微孢子蟲(chóng)多重PCR試劑盒的評(píng)估結(jié)果相一致。究其原因可能是因?yàn)殡p重nest-PCR中同時(shí)加入了兩種腸道病原引物，增加了干擾因素，在一定程度上降低了目的基因片段的擴(kuò)增效率，但誤差仍處于可接受范圍內(nèi)。雙重nest-PCR方法與單重nest-PCR方法相比，只做1次nest-PCR擴(kuò)增就可同時(shí)檢測(cè)出2種病原，大大節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間、精力和試劑消耗，顯著提高檢測(cè)效率。綜上所述，本研究所構(gòu)建的雙重nest-PCR方法具有良好的敏感性、特異性，可用于臨床樣品的檢測(cè)。