鄭 玲,王朋林,陳凱麗,劉林科,王榮軍,張龍現(xiàn),寧長申,菅復(fù)春 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)
養(yǎng)羊業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分,近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人民生活水平的提高,羊肉及其與羊有關(guān)的副產(chǎn)品需求量及質(zhì)量也隨之增加[1],加上近年非洲豬瘟肆虐,肉羊產(chǎn)業(yè)迎來了新的發(fā)展機(jī)遇。同時(shí)也面臨著飼養(yǎng)管理及疫病防控等方面的挑戰(zhàn)。隱孢子蟲、芽囊原蟲、畢氏腸微孢子蟲是3種常見的機(jī)會(huì)性致病原蟲,也是威脅羊的健康和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素之一。同時(shí),這3種蟲均有人獸共患種類或基因型,可致人出現(xiàn)如腹瀉、腹痛、嘔吐等各種胃腸道癥狀。為了解我國羊腸道原蟲病原的種類與基因型,本研究對(duì)我國部分地區(qū)羊腸道隱孢子蟲、芽囊原蟲、畢氏腸微孢子蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查,以期為我國羊腸道原蟲病、人獸共患病的防控提供參考依據(jù)。
1.1 樣本來源2017年6月—2018年12月對(duì)河南、陜西、遼寧、內(nèi)蒙古、貴州、新疆6省放牧或舍飼羊群隨機(jī)采集糞便樣品935份,其中陜西68份、河南292份、遼寧35份、內(nèi)蒙23份、貴州108份、新疆409份。每份樣品采集10~20 g,采集后保存于潔凈自封袋中,記錄其采集地點(diǎn)、采樣時(shí)間、臨床癥狀等樣品信息。將采集好的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于4℃冰箱備檢。
1.2 PCR檢測(cè)參照OMEGA糞便全基因組 DNA 提取試劑盒說明書提取樣品DNA,采用巢氏PCR方法對(duì)樣品分別進(jìn)行隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲檢測(cè)。參考肖立華等[2]擴(kuò)增隱孢子蟲基于SSU rRNA基因的引物和反應(yīng)條件對(duì)隱孢子蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目的片段為830 pb?;贗TS基因?qū)Ξ吺夏c微孢子蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3],目的片段大小約為389 bp?;赟SU r RNA基因?qū)ρ磕以x進(jìn)行單輪PCR擴(kuò)增[4],目的片段約為600 bp。將最后1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)觀察,并拍照記錄。
1.3 3種原蟲病原的基因型鑒定分別基于隱孢子蟲、芽囊原蟲SSU r RNA、畢氏腸微孢子蟲ITS基因進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物使用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和拍照,根據(jù)凝膠電泳結(jié)果,將與陽性對(duì)照片段大小一致的第2輪PCR產(chǎn)物委托北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。對(duì)陽性樣品序列經(jīng) GenBank同源搜索、ClustalX 2.13軟件比對(duì)確定病原種類和基因型。
2.1 羊隱孢子蟲感染情況及蟲種鑒定通過PCR檢測(cè)法,發(fā)現(xiàn)羊隱孢子蟲的總感染率為 5.6%(52/935),其中河南隱孢子蟲感染率最高,為16.8%(49/292)。陜西、遼寧的感染率分別為1.5%(1/68)和5.7%(2/35)。貴州、內(nèi)蒙、新疆3地采集的樣品中均未檢出隱孢子蟲。52個(gè)陽性樣品經(jīng)測(cè)序分析后共發(fā)現(xiàn)3種隱孢子蟲種,分別為肖氏隱孢子蟲(C.xiaoi,n=20)、泛在隱孢子蟲(C.ubiquitum,n=28)和微小隱孢子蟲(C.parvum,n=4)。河南有3種隱孢子蟲,陜西1種為泛在隱孢子蟲,遼寧鑒定出1種為肖氏隱孢子蟲(表1,圖1)。
M.DL2000 DNA Marker;1~22.樣品;P.陽性對(duì)照;N.陰性對(duì)照
表1 不同地區(qū)羊隱孢子蟲的感染情況
2.2 羊芽囊原蟲感染情況及基因亞型鑒定通過對(duì)935份樣品芽囊原蟲的SSU rRNA基因擴(kuò)增,共有112份成功擴(kuò)出長度約600 bp的目的基因。芽囊原蟲總感染率為 12.0%(112/935),其中內(nèi)蒙古芽囊原蟲感染率最高為39.1%(9/23)。河南、貴州、陜西、遼寧芽囊原蟲的感染率分別為31.5%、4.6%、7.4%和2.9%,而新疆樣品未檢出芽囊原蟲。112個(gè)陽性樣品經(jīng)測(cè)序分析,共鑒定出6種芽囊原蟲亞型,其中河南有5種,分別為ST10、ST1、ST4、ST5和ST14,貴州有ST10、ST6 2種亞型,陜西則為ST10、ST14 亞型,內(nèi)蒙古流行ST10、ST5 兩種亞型,遼寧僅鑒定出ST10亞型(表2,圖2)。
表2 不同地區(qū)羊芽囊原蟲的感染情況
M.DL2000 DNA Marker;1~9:樣品;P.陽性對(duì)照;N.陰性對(duì)照
2.3 羊畢氏腸微孢子蟲感染情況及基因型鑒定經(jīng)畢氏腸微孢子蟲的SSUr RNA基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),羊畢氏腸微孢子蟲的總感染率為35.0%(324/935)。通過序列比對(duì)分析,共檢測(cè)出11種已報(bào)道基因型,分別為BEB6、CDE13、CHC8、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-I、EbpC、I、OEBI。各地區(qū)具體感染畢氏腸微孢子蟲情況見表3、圖3,4。
M.DL2000 DNA Marker;1~22.樣品;P.陽性對(duì)照;N.陰性對(duì)照
▲:為本研究中確定的部分序列
表3 不同地區(qū)羊畢氏腸微孢子蟲的感染情況
3.1 隱孢子蟲本研究中隱孢子蟲的總感染率為5.5%(52/935),低于此前報(bào)道的我國青海羊隱孢子蟲感染率(12.3%)[5],但與西澳大利亞(6.5%)[6]以及我國甘肅(4.5%)[7]、安徽(5.8%)[8]、鄭州(3.26%)[9]感染率相似,本次調(diào)查在新疆未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染,而QI等[10]對(duì)新疆羊隱孢子蟲感染調(diào)查發(fā)現(xiàn)該蟲感染率為0.9%。不同養(yǎng)殖模式下,山羊隱孢子蟲感染存在差異[11],感染率的差異可能與羊的飼養(yǎng)環(huán)境和檢測(cè)方法等因素有關(guān)。因此,未來需要開展更多分子生物學(xué)研究,以便深入了解羊隱孢子蟲的傳播特征。本研究共鑒定出3種隱孢子蟲蟲種:肖氏隱孢子蟲、泛在隱孢子蟲和微小隱孢子蟲,這一結(jié)果與此前齊萌等[10]對(duì)新疆地區(qū)調(diào)查的結(jié)果一致。LI等[5]在對(duì)青海綿羊的調(diào)查發(fā)現(xiàn)肖氏隱孢子蟲和泛在隱孢子蟲。本研究中河南地區(qū)羊隱孢子蟲感染率最高,且發(fā)現(xiàn)3種隱孢子種,其中微小隱孢子蟲和泛在隱孢子蟲具有人獸共患性。提示應(yīng)加強(qiáng)羊場(chǎng)糞污管理,防止糞便污染環(huán)境而導(dǎo)致人的感染。
3.2 芽囊原蟲芽囊原蟲是寄生在人和多種動(dòng)物腸道、分布廣泛的一種厭氧型真核微生物[12]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)5個(gè)地區(qū)羊群有芽囊蟲感染,總感染率為12.0%(112/935)。DENG等[13]、XIAO等[14]分別在世界上首次報(bào)道我國四川大熊貓和湖北恩施復(fù)齒鼯鼠芽囊原蟲感染情況(表4)。伊朗ASGHARI等[15]首次報(bào)道在烏鴉和鴿子糞樣檢測(cè)并鑒定出芽囊原蟲,感染率分別為44.4%和42.9%。顧有方等[16]對(duì)安徽省及周邊地區(qū)羊人芽囊原蟲感染率調(diào)查中發(fā)現(xiàn),山羊感染率為0.26%,綿羊人芽囊原蟲感染率為6.0%,均低于本次調(diào)查的羊芽囊原蟲感染率(12.0%),其綿羊感染率與WANG等[17]報(bào)道的我國黑龍江綿羊芽囊原蟲5.5%感染率相似。地理環(huán)境、季節(jié)、樣本量、飼養(yǎng)管理方式等都會(huì)影響腸道寄生蟲的感染與傳播。
基于芽囊原蟲SSU rRNA 基因核酸差異,至今已鑒別出22個(gè)芽囊原蟲基因亞型ST1-ST9為人獸共患基因亞型[18]。謝世臣[19]在我國云南省黑山羊中發(fā)現(xiàn)3個(gè)已知基因型(ST5、ST10、ST14)和4個(gè)新基因型(ST-novel1、ST-novel2、ST-novel3 和 ST-novel4),本研究共發(fā)現(xiàn)6種芽囊原蟲的基因亞型,包括與上述報(bào)道相同的ST5、ST10、ST14 3個(gè)基因亞型和ST1、ST4、ST6亞型。本次調(diào)查,河南、貴州、內(nèi)蒙古的羊糞樣中共發(fā)現(xiàn)ST1、ST4、ST5、ST6 4個(gè)人獸共患亞型。因此,相關(guān)地區(qū)應(yīng)加強(qiáng)公共衛(wèi)生宣傳,提高羊養(yǎng)殖從業(yè)人員的自我防護(hù)意識(shí),防止人獸共患原蟲病的傳播(表4)。
表4 2018-2019年人和動(dòng)物芽囊原蟲感染種類和亞型分布
3.3 畢氏腸微孢子蟲畢氏腸微孢子蟲是人和多種動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的人獸共患原蟲[20]。在世界范圍內(nèi),關(guān)于羊畢氏腸微孢子蟲的報(bào)道較少,巴西[21]和泰國[22]羊畢氏腸微孢子蟲的感染率相同,均為19.2%,明顯低于本次調(diào)查的感染率(34.7%),但高于杜海利等[23]調(diào)查的河南羊畢氏腸微孢子蟲9.23%。畢氏腸微孢子蟲基因型經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析可劃分為9個(gè)組,其中Group1具有人獸共患性,是9個(gè)進(jìn)化組中感染宿主范圍最廣的一個(gè)。其余8個(gè)組群具有宿主特異性。羊主要感染Group2中的基因型[24]。本研究中共發(fā)現(xiàn)11種已知的基因型,分別為BEB6、CDE13、CHC8、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-I、EbpC、I和OEBI、其中,BEB6為優(yōu)勢(shì)基因型。為鑒定本研究中的畢氏腸微孢子蟲基因型和已報(bào)道蟲株的關(guān)系,經(jīng)構(gòu)建進(jìn)化樹分析顯示,本研究11種基因型中,Ebpc分布在遺傳屬于Group1,為人獸共患基因型。EBE6、CHD3、CHG1、CHG3、CHG5、COS-1、I和OEBI屬于Group2,具有宿主特異性和潛在人獸共患性。BEB6也是羊上常見的基因型,該型宿主范圍范圍廣,既可感染人,也可感染動(dòng)物,具有潛在的人獸共患性。據(jù)以往對(duì)西藏地區(qū)羊的畢氏腸微孢子蟲,鑒定出12種基因型[38]。其中也同樣包括 BEB6 在內(nèi) 5個(gè)已知基因型和8個(gè)新基因型。
通過對(duì)我國6省區(qū)12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的羊腸道寄生蟲檢測(cè)發(fā)現(xiàn),我國羊腸道寄生蟲感染普遍存在。經(jīng)基因分析發(fā)現(xiàn),隱孢子蟲、芽囊原蟲、畢氏腸微孢子蟲3種原蟲中均有人獸共患種類或基因型/基因亞型。為保障公共衛(wèi)生安全,應(yīng)在加強(qiáng)對(duì)羊只飼養(yǎng)管理的同時(shí),還要提高從業(yè)人員對(duì)寄生蟲感染和危害的認(rèn)識(shí),做好自身防護(hù),避免人獸共患病的發(fā)生,保障經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益雙豐收。