mgrB和mcr-1在耐多黏菌素豬大腸桿菌中的作用

鄺啟紅，李文婭，李垠樹，賈雅婷，胡功政，苑 麗 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

多黏菌素是一種廣譜抗革蘭陰性菌的陽(yáng)離子多肽，主要用于治療多重耐藥革蘭陰性菌感染，尤其是產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌導(dǎo)致的感染。近年來(lái)，耐多黏菌素的腸桿菌科細(xì)菌日益增多，導(dǎo)致人醫(yī)和獸醫(yī)臨床防控耐藥革蘭陰性菌感染更加困難。目前已闡明多黏菌素的耐藥機(jī)制主要有2種：染色體介導(dǎo)的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PmrAB和PhoPQ的表達(dá)量升高及其上游阻遏蛋白MgrB的特異性突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr[1-2]。mcr基因具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性，細(xì)菌產(chǎn)mcr后會(huì)導(dǎo)致菌體內(nèi)磷酸乙醇胺合成增多，從而修飾類脂A，并最終導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)黏菌素耐藥[1]。MgrB是一種47個(gè)氨基酸編碼的跨膜蛋白[3]，是MgrB-PhoPQ-PmrHFIJKLM信號(hào)通路中的負(fù)性調(diào)控蛋白[4-5]，可通過抑制PhoQ組氨酸激酶的活性，阻遏磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給PhoP，從而抑制下游操縱子的表達(dá)[6]。近來(lái)有研究表明：mgrB基因的缺失、變異、插入或截?cái)嗍Щ钜约癿grB啟動(dòng)子區(qū)突變或插入失活，都會(huì)導(dǎo)致PhoPQ系統(tǒng)和pmrHFIJKLM操縱子過表達(dá)[7-9]，進(jìn)而造成細(xì)菌對(duì)多黏菌素耐藥。

細(xì)菌的mgrB基因變異或攜帶mcr基因都會(huì)導(dǎo)致其對(duì)多黏菌素耐藥，但目前尚不清楚在耐多黏菌素大腸桿菌中這兩種機(jī)制存在的差異。本試驗(yàn)對(duì)收集的165株豬源大腸桿菌采用微量肉湯稀釋法測(cè)定多黏菌素的敏感性，并對(duì)耐藥菌株的mcr-1～mcr-5基因以及mgrB基因進(jìn)行檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)分析，進(jìn)而評(píng)估m(xù)grB和mcr-1在大腸桿菌對(duì)多黏菌素耐藥的貢獻(xiàn)，為防控多黏菌素耐藥的傳播和延緩耐藥趨勢(shì)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒165株大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室于2016—2017年自安徽、河南、湖南、湖北、江西、山西、陜西7省不同地區(qū)豬病料樣本(腸、肺臟、淋巴、脾臟、肝臟等)和健康豬肛門拭子采集分離保存；大腸埃希菌ATCC25922(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心)為質(zhì)控菌；pBAD/HisA質(zhì)粒(由本實(shí)驗(yàn)室保存)具有氨芐西林抗性。

1.2 主要試劑和藥品LB肉湯、LB瓊脂等培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Primer STAR高保真酶，XholⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶，T4DNA連接酶和熒光染料Mix等均購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000、DL5000 Marker為北京擎科新業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品；氨芐西林鈉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；多黏菌素(含量90%)是由河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供。

1.3 菌株復(fù)蘇取甘油保存的菌種并充分振蕩，按1∶100比例無(wú)菌接種于3 mL新鮮的LB肉湯，置于37℃振蕩培養(yǎng)12 h，用無(wú)菌接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液劃線接種于LB瓊脂平板上，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)12 h，后挑取單個(gè)菌落接種于LB肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后備用。

1.4 質(zhì)粒提取pBAD/HisA質(zhì)粒的提取按照美國(guó)OMEGA公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書進(jìn)行，將收集的液體置于-20℃保存。

1.5 藥物敏感性測(cè)定

1.5.1藥液的配制 用分析天平稱取多黏菌素和氨芐西林鈉適量，無(wú)菌配制為5 120 mg/L，0.22 μm濾膜過濾分裝至1.5 mL EP管中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2MIC值測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法[10]測(cè)定多黏菌素對(duì)165株豬大腸桿菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concertration,MIC)，結(jié)果按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判讀，大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌。

1.6 多黏菌素耐藥基因的檢測(cè)

1.6.1菌株DNA提取 采用常規(guī)煮沸法[11]提取各菌株的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的mgrB核苷酸序列，應(yīng)用primer 5.0分析軟件設(shè)計(jì)引物，mcr-1～mcr-5引物序列參考相關(guān)文獻(xiàn)，由上海生物工程有限責(zé)任公司合成。其中,mgrB-F/mgrB-R包含mgrB基因及其上游啟動(dòng)子區(qū)，引物序列見表1。

表1 多黏菌素耐藥基因PCR擴(kuò)增的引物序列

1.6.3多黏菌素耐藥基因比對(duì)分析 PCR檢測(cè)并測(cè)序分析耐藥豬源大腸桿菌的mcr-1～mcr-5流行情況。mgrB基因全序列及其啟動(dòng)子區(qū)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后，用T4DNA Ligase 4℃過夜連接至pBAD/HisA質(zhì)粒，連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用引物mgrB-F/mgrB-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并提取重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，送至上海生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件分析，以大腸桿菌K-12 MG1655為參照菌，進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 豬大腸桿菌對(duì)多黏菌素的敏感性測(cè)定多黏菌素對(duì)165株豬大腸桿菌的MIC值分布見圖1，其中147株(89.1%)對(duì)多黏菌素耐藥，MIC的范圍為4～32 mg/L，且MIC=16 mg/L時(shí)菌株數(shù)最多，有82株。MIC值≤1 mg/L共有18株，敏感率為10.9%。

圖1 165株豬源大腸桿菌對(duì)多黏菌素的MIC值分布

2.2mcr耐藥基因的鑒定PCR檢測(cè)耐多黏菌素豬大腸桿菌的mcr-1～mcr-5基因。結(jié)果顯示，147株耐多黏菌素的豬大腸桿菌中除EPF25菌未檢出mcr基因外，其余146株菌都僅攜帶mcr-1基因(圖2)，所有菌株均未檢出mcr-2～mcr-5基因。

M.DL2000 DNA Marker；1～20.部分多黏菌素耐藥菌；21.陽(yáng)性對(duì)照；22.陰性對(duì)照

2.3mgrB基因的突變將mgrB基因及其啟動(dòng)子區(qū)連接pBAD/HisA載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，提取重組質(zhì)粒，PCR鑒定擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段并經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切證實(shí)為mgrB-pBAD/HisA重組質(zhì)粒(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker；1.pBAD/HisA；2～4.pBAD/HisA-mgrB

以大腸桿菌K-12MG1655(GenBank號(hào)：NZ_CP014348.1)為參照菌株，mgrB基因經(jīng)PCR檢測(cè)并測(cè)序比對(duì)分析。結(jié)果表明,mgrB啟動(dòng)子區(qū)變異的有104株(70.7%，104/147)，且均攜帶mcr-1基因，其中99株菌有相同的堿基突變位點(diǎn)，均為mgrB編碼區(qū)上游12 bp處的A→G堿基；3株菌(E176、E186、E224)含2個(gè)堿基突變位點(diǎn)：編碼區(qū)上游12 bp 處的AG堿基和27 bp處的C→T堿基突變；E193菌(編碼區(qū)上游44 bp處G→A堿基突變)和EPD04菌(編碼區(qū)上游38 bp處C→G堿基突變)僅含1個(gè)突變位點(diǎn)，且與上述不同。mgrB編碼區(qū)氨基酸突變的有11株(0.07%，11/147)，其中僅有EPF25菌不含mcr基因；有6株菌(EPA05、EPA06、EPA09、EPA25、EPA27和EPD11)均為33位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔?株菌(E8、E180、E221)是31位的天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?，EPD23菌為33位的谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸，EPF25菌為42位的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。代表性菌株mgrB基因及其啟動(dòng)子區(qū)序列已提交至NCBI，獲得的GenBank序列號(hào)見表2。比較多黏菌素對(duì)受試菌的MIC值及耐藥菌mcr-1基因、mgrB變異之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)它們之間的相關(guān)性不明顯，豬大腸桿菌對(duì)多黏菌素耐藥是由于mcr基因和mgrB變異共同作用的結(jié)果。

表2 耐多黏菌素的大腸桿菌mgrB(與K-12MG1655相比)的突變位點(diǎn)

3 討論

近年來(lái)，mgrB基因的突變、缺失或者插入序列在多黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌中已有報(bào)道，且已被證明在肺炎克雷伯菌黏菌素耐藥中起重要作用[4,14-15]。大腸桿菌多黏菌素耐藥機(jī)制的相關(guān)研究主要集中于質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因[8,16]。肺炎克雷伯菌的mgrB啟動(dòng)子區(qū)插入類IS903序列可引起mgrB表達(dá)量顯著下降，從而導(dǎo)致PhoPQ系統(tǒng)和pmrHFIJKLM操縱子過表達(dá)，最終使該菌對(duì)多黏菌素表現(xiàn)耐藥[17]。同時(shí)，OLAITAN等[18]在患者中分離的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌中的mgrB啟動(dòng)子區(qū)也發(fā)現(xiàn)IS903插入序列。HAEILI等[19]在mgrB啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)IS插入序列。但有關(guān)mgrB啟動(dòng)子區(qū)堿基突變的相關(guān)報(bào)道尚未見。本研究在多黏菌素耐藥的147株菌中檢測(cè)到104株mgrB啟動(dòng)子區(qū)堿基突變，推測(cè)mgrB啟動(dòng)子區(qū)突變可能會(huì)導(dǎo)致mgrB基因表達(dá)減少，進(jìn)而導(dǎo)致PhoPQ系統(tǒng)上調(diào)，降低大腸桿菌對(duì)多黏菌素的敏感性，但尚須要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明有11株耐多黏菌素豬大腸桿菌的mgrB編碼區(qū)氨基酸發(fā)生突變，且以往研究已證明這3處氨基酸突變與細(xì)菌對(duì)多黏菌素耐藥相關(guān)。EPF25菌的mgrB基因發(fā)生N42S突變，該突變與DAGHER等[20]在黎巴嫩醫(yī)院中分離的耐多黏菌素陰溝腸桿菌的mgrB基因中的突變相同；2017年，POIREL等[21]也在耐多黏菌素動(dòng)物源肺炎克雷伯菌中的mgrB中發(fā)現(xiàn)了N42Y突變。2019年，HUANG等[22]從中國(guó)食用動(dòng)物收集的大腸桿菌分離株中檢出mgrB基因的D31G突變，該突變也同樣發(fā)生在本試驗(yàn)的E8、E180和E221等3菌株中。2019年，KIM等[23]在韓國(guó)豬源大腸桿菌mcr基因陰性分離株中檢出mgrB的Q33R突變，而本試驗(yàn)在大腸桿菌EPA05、EPA06、EPA09、EPA25、EPA27和EPD11等6株菌中檢出存在同樣的氨基酸突變。推斷mgrB基因的31、33和42位的氨基酸突變與細(xì)菌對(duì)多黏菌素產(chǎn)生耐藥密切相關(guān)。

2018年，ZHANG等[24]發(fā)現(xiàn)當(dāng)肺炎克雷伯菌中因mgrB失活而呈現(xiàn)對(duì)多黏菌素高度耐藥后，既使該菌株再獲得mcr-1基因也不會(huì)引起其對(duì)多黏菌素耐藥程度的改變，故猜測(cè)失活的MgrB可能掩蓋了mcr-1基因的功能。而齊小梅等[7]在大腸桿菌耐藥菌中未檢測(cè)到mgrB突變，并認(rèn)為大腸桿菌對(duì)黏菌素耐藥的主要原因是獲得mcr-1基因。本試驗(yàn)比較多黏菌素對(duì)受試菌的MIC值及耐藥菌mcr-1基因、mgrB變異之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)它們之間的相關(guān)性不明顯，說明豬大腸桿菌對(duì)多黏菌素耐藥是由于mcr基因和mgrB變異共同作用的結(jié)果。