共表達PCV2 Cap蛋白和IL-2重組變異株偽狂犬病病毒構(gòu)建及對小鼠的免疫原性

時慶賀，馬寧寧，劉 占，鄧夢夢，郭子儀，史志斌，陳 陸，王川慶 (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。PCV2感染能夠引起機體產(chǎn)生嚴重的免疫抑制，易并發(fā)和繼發(fā)其他傳染病，從而增加豬群的發(fā)病率和死亡率。ORF2編碼的Cap蛋白可與宿主細胞的病毒受體結(jié)合，是PCV2主要的免疫原蛋白[1-3]。自2011年底以來，偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)變異株在我國大部分地區(qū)流行造成豬偽狂犬病(porcine pseudorabies，PR)再次暴發(fā)，已有的PR基因缺失活疫苗不能對PRV變異毒株提供100%保護的報道[4]。白介素2(interleukin 2，IL-2)作為免疫佐劑能誘導(dǎo)T淋巴細胞增殖和分化，增強自然殺傷細胞的殺傷作用，提高單核巨噬細胞吞噬和抗原識別能力，在細胞和體液免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，克服了傳統(tǒng)佐劑的缺點[5-7]。因此，IL-2有望成為一種安全、經(jīng)濟、高效的新型免疫佐劑。基于PR基因缺失活疫苗的成功應(yīng)用以及PRV大部分基因如TK基因[8]是病毒復(fù)制非必需的。因此，將PRV流行變異株作為載體，在其基因組上插入外源基因，構(gòu)建病毒活載體疫苗可達到“一針多防”的效果[9]。本研究擬將PCV2 YY株ORF2和豬IL-2基因插入到前期用PRV QYY變異株構(gòu)建的rPRV-gE-/TK-/EGFP+缺失的TK基因位點，評價重組病毒免疫原性，以期獲得有效預(yù)防PMWS及PR的重組活載體疫苗株。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞及毒株含有CMV啟動子和polyA尾的pZJ-1真核表達載體及以pMD18-T為載體含有PRV TK基因上下游同源臂的重組質(zhì)粒pTK、rPRV-gE-/TK-/EGFP+毒株和rPRV-gE-/TK-/ORF2+重組病毒為本實驗室構(gòu)建并保存；E.coliDH5α感受態(tài)細胞、非洲綠猴腎細胞(Vero)、人腎上皮細胞(293T)、倉鼠腎細胞(BHK-21)、PRV QYY株(2012年分離流行株)和PCV2 YY毒株(PCV2d)為實驗室保存。

1.2 主要試劑羊抗豬IL-2多克隆抗體購自Novus公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗羊、HRP-羊抗鼠IgG和FITC-羊抗鼠IgG購自三鷹生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司；抗鼠CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PercP、IFN-γ-APC、IL-4-APC 和IL-12單克隆抗體、Brefeldin A、Fixation Buffer、Perm Wash Buffer和Cell Staining Buffer為Biolegend公司產(chǎn)品；細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK-8)購自武漢博士德有限公司；抗PCV2 Cap鼠單克隆抗體和原核表達的Cap蛋白為本實驗室制備。

1.3 重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+的構(gòu)建據(jù)GenBank收錄 PCV2(KU960941.1)和 IL-2(X58428.1)基因序列，應(yīng)用Primer Primer 5.0設(shè)計特異性引物F1/R1和F2/R2，分別用于擴增PCV2 ORF2和IL-2基因；在TK基因上游同源臂(TKU)及下游同源臂(TKL)設(shè)計1對特異性引物F3/R3，擴增含有TK基因上、下游同源臂和ORF2-IL-2基因表達框的片段TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL(表1)。相應(yīng)限制性內(nèi)切酶分別雙酶切ORF2和IL-2基因擴增片段，KpnⅠ、HindⅢ雙酶切pZJ-1質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物純化連接，得到重組質(zhì)粒pZJ-ORF2-IL-2。NheⅠ和SpeⅠ雙酶切pZJ-ORF2-IL-2得到CMV-ORF2-IL-2-polyA片段，與用SpeⅠ酶切并進行去磷酸化處理的pTK連接，得到重組質(zhì)粒pTK-ORF2-IL-2并進行酶切鑒定。用高保真酶以pTK-ORF2-IL-2為模板通過PCR擴增出TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL，經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定及分離純化。在6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)293T細胞單層長至80%時，參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒說明，將TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL基因片段與rPRV-TK-/gE-/EGFP+基因組DNA共轉(zhuǎn)染，細胞病變80%時收毒、離心取上清接種Vero細胞，待細胞出現(xiàn)病變，在熒光倒置顯微鏡下挑取無熒光蝕斑并連續(xù)純化鑒定，得到重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+。

表1 引物序列信息

1.4 Western blot鑒定重組病毒Cap蛋白和IL-2表達重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種BHK-21細胞，細胞病變80%時棄上清，RIPA(含1 mmol/L蛋白酶抑制劑)裂解細胞后收取蛋白；取 20 μL SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入抗Cap蛋白單抗和抗IL-2多克隆抗體，37℃反應(yīng)2 h；TBST洗3次，分別加入HRP-兔抗鼠二抗和HRP-兔抗羊二抗，搖床中60 r/min孵育1 h；TBST洗3次，ECL顯色試劑盒顯色。

1.5 重組病毒一步生長曲線測定分別將重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/EGFP+和PRV QYY親本株按1 MOI接種于6孔板中單層Vero細胞，每隔6 h收取病毒液，凍融3次，測定不同時間點病毒滴度，按Reed-Muench法計算TCID50，繪制病毒一步生長曲線。

1.6 重組病毒對小鼠的安全性試驗選擇25只6～8周齡健康且PRV、PCV2血清學(xué)檢測均為陰性的昆明鼠，隨機分為5組，每組5只。1～3組分別以每只105TCID50、106TCID50、107TCID50劑量接種rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+；第4組接種 PRV QYY毒株,105TCID50/只；第5組注射100 μL DMEM作為陰性對照背部皮下注射，每天觀察鼠的臨床變化，觀察期為14 d。

1.7 重組病毒對鼠的免疫原性評價將25只雌性昆明鼠隨機分成5組，每組5只，免疫方案見表2。首免時及隨后每周對小鼠進行斷尾采血并分離血清，分別用前期建立的間接ELISA方法[10]和中和抗體試驗檢測各組小鼠血清中抗PCV2抗體及PRV中和抗體水平；二免后4周，無菌分離并制備3×106個/mL的各免疫組鼠脾臟淋巴細胞懸液，并加入Cap蛋白刺激(5 mg/L)，利用細胞增殖及細胞活性檢測試劑盒(CCK8)檢測各組鼠淋巴細胞增殖活性，以刺激指數(shù)(SI)作為淋巴細胞增殖的標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻[11-12]方法進行改進，取專用流式管分別加入1 mL上述各組細胞懸液；加入 Cap蛋白(5 mg/L)刺激1 h；加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin A(1 000×)，1 μL/管，作用4 h；Cell Staining Buffer洗滌細胞，每管加入1 μg 抗鼠CD3-FITC、0.25 μg CD4-PE和0.25 μg CD8-PerCP，輕輕混勻4℃避光孵育30 min；洗滌細胞，室溫避光下用0.5 mL Fixation buffer固定20 min；充分洗滌細胞，室溫避光下加入1 mL Perm Wash Buffer進行細胞打孔10 min；分別加入1 μg 抗鼠IFN-γ-APC、0.25 μg IL-4-APC或0.25 μg IL-12-APC，室溫避光孵育30 min；Perm Wash Buffer充分洗滌細胞，用500 μL 1%多聚甲醛固定液重懸固定細胞，BD FACS Aria Ⅲ流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析各免疫組小鼠脾臟CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞變化及IFN-γ、IL-4和IL-12細胞因子的分泌水平。

表2 小鼠分組與免疫方案

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 20.0進行分析，差異比較采用t檢驗，以P<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒的構(gòu)建與鑒定TKU-CMV-ORF2-IL-2-polyA-TKL基因片段與rPRV-TK-/gE-/EGFP+基因組DNA共轉(zhuǎn)染293T細胞進行同源重組，轉(zhuǎn)染混合液離心取上清接種Vero細胞，倒置熒光顯微鏡下挑取無熒光蝕斑并連續(xù)純化。Western blot檢測重組病毒Cap和IL-2蛋白表達結(jié)果見圖1。PCV2 Cap蛋白大小為27.8 kDa，IL-2大小約為15.0 kDa，與預(yù)期相符，重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能夠表達Cap和IL-2蛋白，表明重組病毒構(gòu)建成功。

M.預(yù)染蛋白Marker;A1.PCV2 YY株接種PK15細胞作為陽性對照;A2/B1.未接毒細胞空白對照;A3/B2.rPRV-gE-/TK-EGFP+接毒陰性對照;A4/B3.rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種BHK-21細胞收取蛋白

2.2 重組病毒一步生長曲線rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/EGFP+和PRV QYY親本株在Vero細胞上一步生長曲線見圖2。結(jié)果顯示，重組病毒與PRV QYY株及雙缺失毒株有相類似的生長動力學(xué)，隨著時間的增加病毒滴度逐漸增加，42 h時達到最高，隨后開始下降，增殖速度和病毒滴度與雙缺失毒株相似。

圖2 重組病毒和親本毒株的一步生長曲線

2.3 重組病毒對小鼠的安全性PRV QYY接種小鼠出現(xiàn)精神沉郁、角弓反張、奇癢等癥狀，3 d內(nèi)全部死亡。接種3種不同劑量重組病毒的試驗小鼠及陰性對照組在14 d的觀察期內(nèi)均沒有發(fā)病癥狀，狀態(tài)良好，說明重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+的毒力大大減弱，致病性降低。

2.4 免疫小鼠抗PCV2抗體間接ELISA方法測定各組鼠血清中抗PCV2抗體水平見圖3。rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/ORF2+與PCV2亞單位疫苗免疫小鼠的抗體水平在首免后3周內(nèi)迅速升高，在二免后抗體水平呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，三者抗體水平變化趨勢一致，且在二免后rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+與PCV2亞單位疫苗免疫組抗體水平相差不大，但均高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組。DMEM和PR活疫苗免疫小鼠均沒產(chǎn)生抗PCV2抗體。結(jié)果表明，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生抗PCV2抗體，豬IL-2可以增強機體特異性體液免疫。

圖3 免疫小鼠抗PCV2抗體水平變化

2.5 免疫小鼠抗PRV中和抗體水平免疫小鼠抗PRV中和抗體結(jié)果見圖4，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+與PRV活疫苗免疫組在首免后2周均產(chǎn)生了抗PRV中和抗體，且中和抗體水平與rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組相比差異顯著(0.01

注：*.0.01

2.6 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗及細胞因子的檢測

2.6.1免疫小鼠脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 免疫小鼠脾臟淋巴細胞增殖活性結(jié)果顯示，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+和PCV2亞單位疫苗免疫組的脾臟淋巴細胞受Cap蛋白刺激后增殖最為明顯，淋巴細胞體積變大、數(shù)量增多，DMEM組淋巴細胞狀態(tài)沒有明顯變化，說明重組病毒能誘導(dǎo)T淋巴細胞的增殖。從圖5可知，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組與DMEM對照組和PRV活疫苗免疫組相比小鼠脾臟淋巴細胞增殖活性差異極顯著(P<0.01)，與rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組相比差異顯著(0.01

圖5 免疫小鼠T淋巴細胞增殖活性

2.6.2免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞群及相關(guān)細胞因子檢測 免疫小鼠脾臟CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群變化及細胞因子的分泌水平見圖6。與DMEM對照組相比，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+、rPRV-gE-/TK-/ORF2+、PCV2亞單位疫苗及PRV活疫苗免疫組的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞的百分比及分泌特異性IFN-γ、IL-4和IL-12的水平均明顯升高，且rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組最高，說明重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+能引發(fā)小鼠的細胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對Cap蛋白的Th1型和Th2型免疫應(yīng)答。

A～C.為CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞水平;D.PCV2 Cap蛋白特異性T淋巴細胞因子表達

3 討論

2011年底，PRV變異株在我國豬場出現(xiàn)，現(xiàn)有商品化疫苗的保護效力顯著下降，不能有效阻斷其傳播和流行[13]。PRV宿主范圍廣、基因組大，可供外源基因插入或替代，缺失一個或多個病毒復(fù)制非必需基因，病毒毒力可減弱，而自身繁殖和免疫原性不受影響，攜帶外源抗原基因進入機體內(nèi)，可刺激機體同時產(chǎn)生對PRV和外源抗原的免疫應(yīng)答，且免疫原性持久，克服了滅活疫苗和弱毒疫苗的缺點[14-15]。動物機體出現(xiàn)淋巴細胞減少和免疫功能抑制等特征是感染PCV2的重要標(biāo)志[16]。CD3+代表全T淋巴細胞，包括輔助型T細胞CD4+和殺傷型T細胞CD8+。CD8+可直接殺傷靶細胞，CD4+協(xié)調(diào)免疫細胞間的相互作用。Th1分泌IFN-γ和IL-12促進細胞免疫，Th2分泌IL-4促進體液免疫。因此CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞及特異性IFN-γ、IL-4和IL-12細胞因子的水平變化趨勢可以間接反映機體免疫功能。

本研究中PCV2間接ELISA和PRV血清中和試驗結(jié)果顯示，IL-2基因可以有效增強機體特異性體液免疫作用，但ELISA試驗中抗體水平略低于PCV2亞單位疫苗免疫組。由于本研究PCV2亞單位疫苗是用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達Cap VLPs，通過純化和濃縮后研制的商品化疫苗，其抗原量要高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+重組病毒表達的Cap蛋白量，所以導(dǎo)致PCV2亞單位疫苗免疫組的抗PCV2抗體水平高于rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組，因此要提高重組病毒中外源蛋白的表達量和提高病毒的純度。鼠脾淋巴細胞增殖試驗顯示，rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)明顯高于同等條件下的其他免疫組。細胞亞群及相關(guān)因子檢測顯示，與其他組相比 rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+免疫組的小鼠脾淋巴細胞中的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞的百分比明顯增加，且IFN-γ、IL-4和IL-12細胞因子的分泌水平明顯升高。

綜上，PCV2 YY株ORF2和豬IL-2插入到rPRV-gE-/TK-/EGFP+病毒缺失的TK基因位點，獲得的重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+接種小鼠后均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生不同程度的體液和細胞免疫。重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+比無 IL-2的rPRV-gE-/TK-/ORF2+免疫組在抗PCV2抗體水平、抗PRV中和抗體水平、T淋巴細胞增殖反應(yīng)及T淋巴細胞亞群和相關(guān)因子水平均顯著增加，進一步證實了同時攜帶細胞因子和保護性抗原的疫苗明顯比單獨含有抗原的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的免疫。本試驗所用動物為小鼠而并非本屬動物豬，對IL-2作為免疫佐劑的效果是否有一定影響，還需進一步開展對豬的免疫原性試驗進行驗證。本研究以豬IL-2基因作為免疫佐劑，為研發(fā)同時預(yù)防PR和PCV感染相關(guān)疾病的疫苗提供候選疫苗株。