血清4型禽腺病毒感染SPF雞體內(nèi)各組織中病毒的動態(tài)分布及排毒規(guī)律

欒勇嬌，謝芝勛，王 盛，羅思思，張 蕾，謝麗基，謝志勤，鄧顯文，張民秀，張艷芳，曾婷婷，范 晴 (1.廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

禽腺病毒(avian adenovirus,FAdV)屬于腺病毒科腺病毒屬，是沒有囊膜的雙鏈DNA病毒，可分為5個種(FAdV-A～E，12個血清型(FAdV-1～8a和8b～11)[1]。FAdV引起雞和其他禽類的疾病主要有包涵體肝炎[2]、心包積液綜合征[3]和胃潰瘍[4]。1987年，巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了一種可引起禽類出現(xiàn)心包積液和包涵體肝炎病理變化的疾病，因此稱為“安卡拉病”[5]，又稱為心包積液-肝炎綜合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)，經(jīng)鑒定該病的病原是血清4型禽腺病毒(FAdV-4)，隨后該病在世界上的多個國家流行，如澳大利亞、印度、韓國、日本、伊拉克、智利和南非[6-11]，給全球各地的家禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。2014年以前，我國零星分離到FAdV[12]，自2015年6月，由高致病性的新型FAdV-4引起的HHS在我國山東、河南、安徽、河北、吉林等省份暴發(fā)并迅速傳播[13]。有報道稱種雞、蛋雞、雜交雞、蛋鴨和鵝也可能感染此病毒[13-15]，因此，HHS已成為危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重大疾病之一，嚴(yán)重制約我國家禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4主要侵害3～6周齡的肉雞，死亡率20%～100%[16]，感染該病的典型癥狀是心包內(nèi)積有淡黃色的液體，肝臟腫大、有出血或壞死，腎臟腫大、蒼白[17]。感染該病后，肝臟是其主要的靶器官[18]，組織學(xué)上主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)可見核內(nèi)包涵體[19]。HHS可通過水平和垂直兩種方式進(jìn)行傳播，傳染性強(qiáng)[20]。近幾年國內(nèi)外關(guān)于FAdV-4的研究較多，主要是致病性研究[18,21]和疫苗研制[22-23]，LI等[24]在FAdV-4山東分離株的致病性研究中，檢測接種后前幾日病理變化較為明顯的部分組織器官和泄殖腔棉拭子中的病毒載量。而全面系統(tǒng)的研究FAdV-4感染雞后，病毒在雞體內(nèi)不同組織器官的分布規(guī)律以及雞的排泄規(guī)律的相對較少。

為了探索FAdV-4在雞體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的過程、趨勢及規(guī)律，本試驗以SPF雞為實驗動物，人工感染FAdV-4，通過RT-PCR跟蹤檢測感染后SPF雞組織器官的病毒載量和排毒情況，研究FAdV-4感染SPF雞體內(nèi)組織的分布和排毒，分析其動態(tài)變化規(guī)律，為FAdV-4致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)，并為FAdV-4的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株與SPF雞胚FAdV-4-GX2019-010毒株由本實驗室分離、鑒定、純化并保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器Universal Genomic DNA Kit購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 購自Invitrogen公司；磷酸鹽緩沖物(PBS)、DMEM/F-12培養(yǎng)基購自Corning公司；胎牛血淸(FBS)購自Gibco公司；NanoDrop 2000、Applied Biosystems QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀購自ThermoFisher Scientific公司。

1.3 病毒的增殖取17～18日齡SPF雞胚，用75%的酒精消毒蛋殼表面，制備雞胚原什肝細(xì)胞(CEL)，置于37℃、5% CO2生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其長成單層，取一定量病毒上清液接種細(xì)胞，培養(yǎng)并觀察2～3 d，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(CPE)，低速離心收集細(xì)胞并重懸于DMEM中，反復(fù)凍融，振蕩3次，于4℃、12 000 r/min離心5 min，收集病毒上清于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒TCID50的測定將CEL在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至單層，10倍梯度稀釋，接種96孔細(xì)胞板，每個稀釋度重復(fù)6個孔，并設(shè)置陰性對照，連續(xù)觀察7 d，并記錄CPE，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50為10-7.2/mL。

1.5 人工感染SPF雞及樣品采集將100只3周齡SPF雞隨機(jī)分為2組：試驗組50只，對照組50只。試驗組的SPF雞以0.2 mL/只(TCID50=105.5/mL)的劑量通過滴鼻點眼接種病毒，對照組接種相同劑量的無菌PBS。每日觀察雞只精神狀態(tài)，于感染后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21 d隨機(jī)抽取試驗組和對照組3只雞，采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，放于1 mL含四抗(青霉素、鏈霉素、慶大霉素、制霉菌素)的PBS中，-80℃保存用于檢測SPF雞的排毒情況。剖殺并觀察病變情況，采集胸肌、肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腺胃、胰腺、法氏囊、腎臟、胸腺和腦，-80℃ 保存用于病毒載量的測定。

1.6 病毒DNA的提取及RT-PCR檢測組織和棉拭子樣品按照Universal Genomic DNA Kit說明書提取DNA，將提取的DNA標(biāo)準(zhǔn)化為100 mg/L，以此為模板進(jìn)行RT-PCR。采用實驗室先前制備的陽性質(zhì)粒，梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)品，RT-PCR擴(kuò)增制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗所用的檢測引物：5′-CACGAGCACCTCCAAAGA-3′；5′-TTGTACCCGTCGCAGA-GGAT-3′。反應(yīng)體系：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，RNase Free dH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：50℃ 2 min;95℃ 2 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)；反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線分析，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品Ct值，計算病毒載量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用NanoDrop 2000測定質(zhì)粒濃度，經(jīng)公式計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)為4.21×1010拷貝/μL，將質(zhì)粒按照(4.21×103～4.21×107拷貝/μL)5個梯度稀釋，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的Ct值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，線性方程為y=-3.301x+38.095，斜率為-3.301，y軸截距為38.095，相關(guān)系數(shù)為1，表明線性很好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線

2.2 SPF雞接種FAdV-4后組織器官病毒載量的動態(tài)分布通過RT-PCR檢測組織器官中FAdV-4的拷貝數(shù)(以對數(shù)值表示)，結(jié)果顯示所有的組織器官在感染后1 d便能夠檢測到病毒。在感染后1～21 d，病毒在不同組織器官中的分布和含量存在差異，但整體趨勢都是先增加后減少，感染后5～6 d達(dá)到最大值，其中肝臟、心臟和肺臟中病毒含量較高，肝臟中的病毒載量高達(dá)108拷貝/μL，表明肝臟是FAdV-4的主要靶器官;肺臟和心臟中的病毒載量約為106拷貝/μL。脾臟、胸腺、法氏囊3種免疫器官在感染后6 d達(dá)到最大值，病毒載量為104～106拷貝/μL。腺胃、胰腺和腎臟的病毒載量呈規(guī)律性變化，分別在在感染后5、6 d達(dá)到最大值，而后降低。與其他組織器官相比，肌肉和腦中的病毒載量較低，最大值僅為104拷貝/μL。在感染后6～21 d 組織器官中的病毒載量逐漸下降，在感染后21 d 組織器官中的病毒載量很低，小于100 拷貝/μL(圖2)，整個試驗過程對照組未檢到病毒。

圖2 FAdV-4感染SPF雞不同時間點各組織器官的病毒載量

2.3 SPF雞接種FAdV-4后體外排毒規(guī)律SPF雞感染后1～21 d咽喉和泄殖腔棉拭子中均可以連續(xù)檢測到病毒，咽喉中的排毒量波動不大，甚至在感染后14～21 d僅有微量排毒，主要通過泄殖腔排毒。咽喉和泄殖腔的整體排毒趨勢較為一致，在感染后6 d咽喉和泄殖腔的排毒均達(dá)到最大值，其中泄殖腔的病毒載量高達(dá)6.6×104拷貝/μL，感染6 d 以后排毒量開始下降，到21 d時排毒量很低(圖3),對照組棉拭子未檢測到病毒。

圖3 FAdV-4感染SPF雞的咽喉拭子和泄殖腔拭子的排毒情況

3 討論

近年來，F(xiàn)AdV-4在我國多個省份暴發(fā)，主要感染3～6周齡的肉雞[16]，病程多呈急性經(jīng)過，死亡率可高達(dá)80%[25]，目前發(fā)現(xiàn)種雞、蛋雞和雜交雞也可感染該病[13]，也有少數(shù)報道鵝、鴨子、鵪鶉和鴛鴦也可感染此病毒[26-29]。前人研究發(fā)現(xiàn)，雞感染該病毒后可通過水平和垂直方式傳播[20]，傳染性很強(qiáng)，因此對其傳播途徑、傳播規(guī)律及感染動物體內(nèi)分布的研究顯得尤為重要。

組織器官病毒載量的動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，SPF雞感染FAdV-4后，所有的組織器官均能夠連續(xù)的檢測到病毒，并且在感染后1 d，檢測到病毒，說明FAdV-4能迅速分布到雞組織器官中，甚至在感染后21 d，仍然能夠在SPF雞的各個組織器官中檢測到FAdV-4，說明FAdV-4可以在SPF雞體內(nèi)持續(xù)存在較長時間。脾臟、胸腺和法氏囊3種免疫器官的病毒載量在攻毒后1～6 d呈上升趨勢，在第6天達(dá)到最高，病毒載量從高到低分別為脾(6.27)、法氏囊(5.31)、胸腺(5.12)。表明脾臟是抗感染免疫的主要免疫器官。感染后6 d正是病毒感染的高峰期，病毒迅速入侵免疫器官，并在免疫器官中增殖，使免疫器官受到侵害，免疫功能紊亂，進(jìn)而容易激發(fā)或者并發(fā)其他細(xì)菌、真菌或其他病毒病，導(dǎo)致死亡，這可能是雞感染FAdV-4后具有較高死亡率的原因，與先前的研究結(jié)果一致[30]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4存在于SPF雞的腦中，表明FAdV-4可以穿過血腦屏障，入侵腦并在腦中復(fù)制。但在試驗中并未觀察到SPF雞有明顯的神經(jīng)癥狀，因此FAdV-4是否能夠穿過血腦屏障，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)需要更進(jìn)一步的研究。此外，在肌肉中也有病毒的分布，表明FAdV-4可以在肌肉中復(fù)制，雖然病毒載量相對于其他組織器官較低，但是推測病毒的復(fù)制會破壞肌肉組織，從而導(dǎo)致雞感染后出現(xiàn)蜷縮、不愿移動等癥狀。本試驗中FAdV-4在SPF雞的各個組織器官中分布的部位和含量存在差異，但整體趨勢都是先上升后下降，相同時間點肝臟中的病毒含量要高于其他組織器官，說明肝臟是FAdV-4的主要靶器官，這與前人的研究結(jié)果一致[14,31]。在感染6 d以后組織器官的病毒載量持續(xù)降低，表明SPF雞體內(nèi)的免疫作用對FAdV-4的增殖起到了抑制作用。試驗中所采集的組織器官參與了雞體內(nèi)各大系統(tǒng)的運行，包括消化系統(tǒng)(腺胃、肝臟、胰腺)、呼吸系統(tǒng)(肺臟)、血液循環(huán)系統(tǒng)(心臟)、免疫系統(tǒng)(脾臟、胸腺、法氏囊)、神經(jīng)系統(tǒng)(腦)、泌尿系統(tǒng)(腎臟)等，F(xiàn)AdV-4感染SPF雞后可入侵多個組織器官，從而影響機(jī)體的各項生命活動。

感染后FAdV-4 SPF雞的咽喉和泄殖腔均能夠連續(xù)檢測到病毒，表明SPF雞在感染后可通過呼吸道和泄殖腔這兩種方式進(jìn)行排毒。感染后1 d在泄殖腔和咽喉拭子中可以檢測到病毒，咽喉中病毒的含量要比泄殖腔的含量高，推測與接種方式為滴鼻點眼有關(guān)。病毒在感染后1 d便能夠迅速通過呼吸道和泄殖腔排出體外，提示一些免疫學(xué)上的應(yīng)用，宿主接種疫苗后，F(xiàn)AdV-4迅速排出體外，然后通過消化道和呼吸道進(jìn)入雞體內(nèi)，可以誘導(dǎo)雞的黏膜免疫系統(tǒng)(mucosal immune system,MIS)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，加強(qiáng)對宿主的免疫作用。在感染后5 d排毒量最高，排毒量與組織器官的病毒載量的變化趨勢相同。泄殖腔排出的病毒可以污染飲用水和飼料，從而使病毒通過糞口傳播。咽喉雖然檢測到的排毒量較低，但病毒可通過呼吸釋放到空氣中，通過呼吸道進(jìn)行傳播。通過這些結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAdV-4感染SPF后可通過呼吸道和泄殖腔釋放病毒，導(dǎo)致飼養(yǎng)環(huán)境被污染，推測這應(yīng)該是該病毒傳染性較高的原因。直至試驗結(jié)束，試驗組的SPF雞仍然能夠通過呼吸道和泄殖腔排毒，因此應(yīng)在本試驗基礎(chǔ)上適當(dāng)延長排毒檢測的時間，掌握感染雞的排毒規(guī)律，有助于該疾病的防控。

本試驗將FAdV-4人工感染SPF雞，對感染后1～21 d SPF雞的咽喉、泄殖腔和各個組織器官中的病毒含量和分布進(jìn)行全面系統(tǒng)的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)病毒可以通過呼吸道和泄殖腔釋放病毒，其排毒量存在差異，泄殖腔的排毒量要高于呼吸道，但可以肯定的是，F(xiàn)AdV-4的廣泛感染與呼吸道和泄殖腔病毒的釋放密切相關(guān)，這也為預(yù)防該病的傳播提供了一個有效的措施。此外，在感染后21 d，剩余雞群已無明顯的臨床癥狀，但是仍然能夠檢測到病毒，表明耐過的雞群仍然攜帶病毒，這顯然增加了防控FAdV-4的難度。由于感染FAdV-4后SPF雞通過呼吸道和泄殖腔進(jìn)行排毒，為病毒的水平傳播提供了良好的條件，這提示在生產(chǎn)中，暴發(fā)過FAdV-4的養(yǎng)禽場應(yīng)做好全面的消毒，雞群不宜留作種用，防止病毒的垂直傳播。