二重熒光RT-LAMP對牛病毒性腹瀉病毒和牛輪狀病毒的鑒別診斷

范 晴，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思 (廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea disease virus,BVDV)是2種常見牛腹瀉病毒，癥狀相似，難以區(qū)分。BVDV臨床上常出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、黏膜損傷和趾部損傷，但大多數(shù)感染BVDV的牛為持續(xù)性感染且不表現(xiàn)臨床癥狀，一旦再次接觸相似性抗原便會繼發(fā)為黏膜病，病死率100%。持續(xù)感染的?？赏ㄟ^血液、排泄物等多種途徑水平傳播病毒，還可通過生殖道垂直傳播，且終身帶毒，持續(xù)排毒，成為牛場腹瀉癥的重要傳染源，對養(yǎng)牛業(yè)存在潛在危害。BRV主要感染1～30日齡初生犢牛，可引起犢牛腹瀉、脫水、嘔吐和酸堿平衡[1-4]。2種病毒經(jīng)?；旌细腥?，感染后病程加重，我國每年因腹瀉病引起的經(jīng)濟損失高達數(shù)億元，因此急需建立這2種病的快速檢測技術(shù)，為我國BRV和BVDV的防控提供技術(shù)支持。

目前常用的診斷方法主要有血清學方法、病原分離和分子生物學方法(RT-PCR和熒光RT-PCR)[5-8]。環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種基于PCR發(fā)展起來的新興核酸擴增技術(shù)，它解決了PCR多溫度擴增的技術(shù)難點，采用恒溫擴增，6條引物(針對8個區(qū)域)同時擴增效率增加、敏感性高、特異性好，經(jīng)常應用于疾病診斷及基因篩選[9-12]。多重LAMP是一種高效的LAMP形式，一次LAMP反應，可同時檢測、鑒別多種病原體。但目前國內(nèi)的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能準確地檢測是哪一種病原引起的陽性結(jié)果，都沒有實現(xiàn)真正意義上的鑒別診斷。本研究建立的BRV和BVDV二重RT-LAMP方法，在LAMP引物中標記熒光基團，反應后通過擴增產(chǎn)物的顏色讀取反應結(jié)果，可準確鑒別診斷BVDV和BRV兩種病毒。

1 材料與方法

1.1 毒株及試劑14株BVDV廣西分離株、8株BRV廣西分離株、3株牛支原體(MB)和3株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)由廣西獸醫(yī)研究所分離保存；3株BVDV、1株牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)和2株BRV購自中國獸藥監(jiān)察所；水泡性口炎病毒(VSV)(新澤西NJ型和印第安IND型)、藍舌病病毒(BTV)(4型、8型、9型、15型、17型、18型)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)(O型、A型、AsiaⅠ型)由昆明海關(guān)惠贈。本研究所使用的病毒毒株和菌株來源如表1所示。RNA病毒使用RNA抽提試劑盒(全世金，北京)抽提毒株的RNA，-70℃保存；IBRV和ETEC使用全世金DNA抽提試劑盒(全世金，北京)提取DNA，-20℃保存，備用。

表1 毒株和菌株來源

1.2 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中BVDV的5′端非編碼區(qū)(5′UTR)和BRV的VP6基因保守序列，利用DNAStar MegAlign進行分析比對，用Primer Explore V4設(shè)計2套LAMP引物。每套引物包括4條引物(針對6個位點)：外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，在每條內(nèi)引物FIP的5′端標記熒光基團：BVDV標記FITC熒光，520 nm波長下呈黃綠色，BRV標記CY5.5熒光，694 nm波長下呈大紅色(圖1)。引物均由大連寶生物公司合成。

圖1 二重熒光RT-LAMP引物示意圖

1.3 反應體系的優(yōu)化25 μL反應體系包括如下成份：10×LAMP buffer 2.5 μL、200 mmol/L Tris-HCl、80 mmol/L MgSO4、100 mmol/L KCl、100 mmol/L(NH4)2SO4、8 mol/L甜菜堿、1% 吐溫20、14 mmol/L dNTPs(Sigma，東京，日本)、Bst DNA聚合酶3.0(New England Biolabs,MA,USA)15 U、內(nèi)引物各40 pmol(BVDV-FIP、BVDV-BIP、BRV-FIP和BRV-BIP)、外引物各5 pmol(BVDV-F3、BVDV-B3、BRV-B3和BRV-F3)、RNA模板1 μL。各組份混合均勻，恒溫儀或水浴中 63℃(或60～67℃范圍內(nèi)均可反應)反應90 min，80℃作用5 min 結(jié)束反應。

1.4 標準品的制備用PCR(premixTaq，TaKaRa，大連)擴增BVDV外引物(BVDV-B3，BVDV-F3)228 bp片段和BRV外引物(BRV-B3，BRV-F3)215 bp片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連入pGM-T載體(天根，北京)，轉(zhuǎn)DH5α大腸桿菌培養(yǎng)，經(jīng)藍白斑和PCR篩選陽性重組菌，用質(zhì)粒抽提試劑盒(MidiPlasmidkid，天根，北京)提取重組質(zhì)粒。參照T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說明書將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為RNA，用核酸測定儀Nanodrop 2000(Thermo Scientific,USA)D260測定體外轉(zhuǎn)錄RNA的濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)×10-9×6.02×1023/660×3 100(質(zhì)?？傞L度)。將計算好拷貝數(shù)的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋至濃度為1×107～1拷貝/μL，再將同稀釋度的2種體外轉(zhuǎn)錄RNA等體積混合，制備成RNA標準品(含有BVDV和BRV特異性片段)，-70℃保存?zhèn)溆?，用于驗證二重熒光RT-LAMP檢測方法的敏感性。

1.5 干擾性試驗人工制備模擬混合感染樣品，將BRV和BVDV RNA標準樣品按不同濃度進行混合：樣品1(105BVDV+102BRV)、樣品2(107BVDV+103BRV)、樣品3(102BVDV+106BRV)、樣品4(103BVDV+106BRV)。用二重RT-LAMP檢測，以測試高濃度模板是否會搶奪反應試劑資源，抑制低濃度模板的擴增。

表2 引物序列

1.6 臨床樣品檢測從廣西各地牛場采集144份腹瀉牛的糞便棉拭子，用PBS洗脫后5 000×g離心5 min，取250 μL上清抽提病毒RNA，抽提好的RNA同時用二重RT-LAMP和熒光RT-PCR檢測,熒光RT-PCR具體操作參照文獻[8]進行，將熒光RT-PCR陽性樣品送廣州華大基因公司測序鑒定，以排除非特異性擴增。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗結(jié)果為了評估已建立的二重熒光RT-LAMP方法的特異性，對表1中常見牛病原體病進行擴增。結(jié)果表明，該方法只擴增BRV和BVDV以及BRV和BVDV混合模板。BRV陽性條帶呈紅色，僅在670通道下能看到；BVDV陽性條帶呈黃綠色，僅在520通道下能看到；BVDV和BRV混合模板條帶呈紅綠色混合，在520和670兩個通道下都能觀察到，與其他牛病原體及陰性對照均無反應(圖2)，該方法特異性好。

A.520通道下電泳圖;B.670通道下電泳圖;C.520和670雙通道下電泳圖

2.2 敏感性試驗結(jié)果用已建立的二重熒光RT-LAMP檢測BRV和BVDV混合模板標準品,結(jié)果如圖3，圖3A,B,C是在不同通道下的電泳圖，圖3D為實時濁度圖(由濁度儀loopam LA-320C生成)，二重熒光RT-LAMP最低可檢測到100個BVDV RNA和100個BRV RNA，可見該方法靈敏性高。

1～7.106～1拷貝/μL(BVDV和BRV RNA混合模板標準品);8.陰性對照

2.3 干擾性試驗結(jié)果在同一反應管中存在不同濃度的2種模板時，高濃度的模板不會搶奪試劑資源，低濃度模板也不會被抑制，2種模板能相互不影響實現(xiàn)均一穩(wěn)定的擴增，由此可見該二重熒光RT-LAMP可同時檢測到BVDV和BRV 2種模板(圖4)，干擾性小。

1.105 BVDV+102 BRV;2.107 BVDV+103 BRV;3.102 BVDV+106 BRV;4.103 BVDV+106 BRV

2.4 臨床樣品檢測對144份臨床樣品的檢測結(jié)果如下，熒光RT-PCR檢出BVDV 24份，感染率為18.1%[(24+2)/144]、BRV 9份,感染率為7.6%[(9+2)/144]、BVDV和BRV混合感染2份,感染率為1.4%(2/144)；二重RT-LAMP檢出BVDV 24份，BRV 9份、BVDV和BRV混合感染2份。與熒光RT-PCR方法相比二重RT-LAMP方法敏感性為100.0%，特異性為100.0%。克隆所有的陽性樣品熒光RT-PCR擴增片段，經(jīng)測序鑒定均為陽性。結(jié)果表明，二重RT-LAMP與熒光RT-PCR檢測結(jié)果相同。

3 討論

LAMP是2000年日本研究者NOTOMI等[13]首先開發(fā)出的一種新興恒溫核酸擴增方法，它反應快速，只需1 h就能完成；操作簡便，結(jié)果可憑肉眼讀?。怀杀镜?，只需要一個水浴鍋就能完成反應，基于LAMP的這些優(yōu)點，得到了眾多研究者的青睞。但LAMP也有其局限性就是很難進行多重檢測，其原因是LAMP的3種結(jié)果判定方法(觀察白色沉淀物、加染料看顏色變化和電泳)無論是多重還是單重檢測，呈現(xiàn)的陽性結(jié)果都一樣，不能準確的判斷出是由哪種病原所引起的，因此很難實現(xiàn)多重檢測。

目前我國雖然已有學者建立相關(guān)多重LAMP檢測的報道，但都不是真正的鑒別檢測，不能廣泛的應用在臨床檢測。劉寧偉等[14]建立了多重LAMP檢測沙門菌、副溶血弧菌和單核細胞增生性李斯特菌；趙軍等[15]建立二重LAMP檢測雞蛋中蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌；陳兵等[16]建立禽流感、新城疫和傳染性法氏囊3種家禽病毒多重RT-LAMP檢測方法，這3種方法都是在同一反應體系中加入多套LAMP引物共同反應，這樣只能粗略地檢測樣品是攜帶病原體，但不能準確地鑒別診斷到底是何種病原體。姜侃等[17]建立食品中產(chǎn)毒素性霍亂弧菌和副溶血性弧菌二重LAMP-熔解曲線檢測方法，該方法仍需借助在熒光定量PCR儀進行反應，并在反應后使用熔解曲線分析才能確診病原，對儀器設(shè)備要求高，耗時長，且熔解曲線分析菜花狀LAMP產(chǎn)物，準確率低。王彩霞等[18]建立同時檢測貝類派琴蟲和包納米蟲的雙重LAMP方法，在引物中添加酶切位點，反應后對LAMP產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物通過電泳檢測，通過目的片段的大小來進行進一步的判定結(jié)果，此方法操作復雜，易造成實驗室氣溶膠污染。本研究首次在引物上標記了2種新型熒光基團，CY5.5和FITC,2種熒光基團的吸收光和激發(fā)光均不同，因此在不同的波長下可呈現(xiàn)不同的顏色，例如CY5.5吸收波為670 nm，呈大紅色，F(xiàn)ITC吸收波為520 nm，呈黃綠色。不同的熒光基團，只能在與其匹配的特定通道下觀察到，即在670通道下只能看到CY5.5，無法觀察到FITC，比起觀察白沉淀物、加染料觀察顏色變化等方式更準確。熒光基團標記在內(nèi)引物FIP的5′端，擴增過程中比普通引物需要消耗更多的自由能，DNA模板分子與引物碰撞需要高度配合，可以有效減少假陽性的出現(xiàn)，這是首次實現(xiàn)了真正意義上的多重LAMP鑒別診斷。

表3 二重RT-LAMP和熒光RT-PCR臨床樣品檢測結(jié)果比較 份

LAMP方法的擴增，不需要使用復雜儀器設(shè)備，只需要一個能控溫的恒溫水浴鍋，可在條件簡陋的基層使用，如獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場，實現(xiàn)現(xiàn)場檢疫。若在現(xiàn)場檢疫只需要檢測出腹瀉病陽性樣品，不需要區(qū)分是BVDV或是BRV時，可以在反應后添加染料，用肉眼觀察顏色變化直接讀取結(jié)果。使用鈣黃綠素為染料，將25 μmol/L鈣黃綠素與300 μmol/L氯化錳按10∶1配制為熒光染料工作液，每個反應中加入1 μL熒光染料與反應試劑一起反應，反應后觀察反應管顏色，反應管呈黃綠色為陽性，橙色為陰性。二重熒光RT-LAMP電泳時不需要使用Marker，原因是LAMP產(chǎn)物是一些長度不等的DNA片段混合物，電泳后呈現(xiàn)梯狀條帶，Marker對這些片段無指示意義。本研究使用Bst DNA 聚合酶3.0,該聚合酶不僅擴增效率高，而且具備反轉(zhuǎn)錄功能，因此反應體系中不需要再加入反轉(zhuǎn)錄酶也可以完成反應，省時省成本。

本研究設(shè)計了2套針對BVDV和BRV的特異性LAMP引物，優(yōu)化引物配比及反應條件，成功建立了在同一反應管里鑒別診斷BVDV和BRV二重熒光RT-LAMP檢測方法。該方法特異性好，并對其他病原核酸不發(fā)生非特異性擴增，靈敏度高，每個反應最低能檢測到100個拷貝病毒RNA混合模板，反應條件簡單，只需一臺普通水浴鍋即可完成，具有特異、敏感、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點，適用于牛腹瀉病流行病學調(diào)查和臨床檢測。