口蹄疫A型病毒不同毒株抗原反應(yīng)性

孫燕燕，陳夏輝，李 昕，林 密，李峰松，賀華麗，包艷芳，楊 光，蔣 韜* (.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/口蹄疫國家參考實驗室,甘肅 蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

口蹄疫A型病毒(FMDV)由北部國家傳入我國，主要于20世紀70年代中期以前在國內(nèi)大部分地區(qū)流行，并且一直呈散發(fā)流行態(tài)勢。近幾年，根據(jù)國家口蹄疫(FMD)參考實驗室疫情監(jiān)測分析，我國A型FMDV流行毒株主要為A型Sea-97[1-3]。為了應(yīng)對可能出現(xiàn)的A型FMD突發(fā)事件，避免FMD 的大規(guī)模流行，疫苗免疫在該病防控中具有重要地位[4-6]。從現(xiàn)有疫苗對流行毒株的保護性來看，被免疫的動物所產(chǎn)生的抗體能夠有效抵抗FMDV感染，而且免疫抗體的中和滴度與攻毒保護有著很好的相關(guān)性[7-9]，據(jù)此中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和國家FMD 參考實驗室聯(lián)合開展了A型AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株疫苗免疫攻毒試驗，結(jié)果表明兩種疫苗均對當前流行的A型病毒有效[2]。為準確評估畜群的免疫狀態(tài)，制定合理有效的防預(yù)方案，本研究分別選擇AF/72、Re-A/WH/09(屬于A/Sea-97 G1)和A/GD/MM/13(屬A/Sea-97 G2)株用作備選毒株，通過對不同毒株純化146S抗原以及VP1表達蛋白的抗原反應(yīng)性進行比較試驗，選擇適宜的病毒株作為檢測用抗原。關(guān)于FMDV疫苗株抗原性的比較，目前只針對其免疫原性進行過研究，而對其生產(chǎn)用毒株之間抗原反應(yīng)性的比較尚未見到報道[10-12]。本試驗為了驗證不同A型毒株與田間血清的免疫學反應(yīng)，首次選取FMDVAF/72株、Re-A/WH/09株146S純化抗原及其VP1表達蛋白、A/GD/MM/13株VP1表達蛋白作為檢測用診斷抗原，通過實驗室建立的間接ELISA方法和膠體金免疫層析檢測方法(GICA)方法，對其進行敏感性與特異性評價試驗，篩選出反應(yīng)性最高的檢測用抗原，為選擇更優(yōu)良的FMDV免疫學診斷抗原提供科學依據(jù)，對促進疫病的預(yù)防及監(jiān)測工作的發(fā)展有積極的作用[13-14]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原；原核表達經(jīng)純化復(fù)性后的FMDV AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1蛋白分別由GenScript公司和研究所內(nèi)課題組合成并表達純化；兩種FMD A型毒株(AF/72、Re-A/WH/09)疫苗免疫陽性血清(AF/72和Re-A/WH/09免疫血清各30份)60份、FMD O型陽性血清15份、FMD Asia1型陽性血清10份和FMD 陰性血清15份，共計100份；陽性標準對照(Pc)血清1份(LPB-ELISA抗體效價1∶128)、陰性標準對照(Nc)血清1份(LPB-ELISA抗體效價<1∶8)。

1.2 主要試劑和儀器辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗牛IgG抗體、兔抗羊IgG抗體、兔抗豬IgG抗體均購自Sigma公司；氯金酸購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。超速離心機購自Thermo Fisher公司；XY3000點噴儀、CM3000切條機均購自美國Bio-Dot公司；TP-1900紫外可見分光光度計購自北京普析公司。

1.3 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原146S的制備將滅活好的FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株進行差速、超速離心后再用于150～450 g/L蔗糖密度梯度離心，用紫外分光光度計測定D260值。

1.4 FMDV AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1蛋白純化與鑒定由GenScript公司對AF/72株、A/WH/09株和A/GD/MM/13株進行毒株VP1原核表達，AF/72株的表達載體為PET-30a(+)，A/WH/09株、A/GD/MM/13株的表達載體為PET-21a(+)，均經(jīng)His tag柱純化。經(jīng)純化復(fù)性的VP1蛋白進行SDS-PAGE電泳，分離的蛋白帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用30 g/L的明膠溶液于37℃封閉1 h，PBST充分洗滌，加V(血清)∶V(封閉液)=1∶500倍稀釋的A 型FMDV陽性牛血清，37℃孵育1 h，PBST洗滌6次，每次3 min，再加血清∶封閉液=1∶1 000稀釋的HRP標記兔抗牛IgG，37℃孵育1 h，PBST洗滌6次，每次3 min，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，待出現(xiàn)條帶后定影，觀察特異性條帶。

1.5 診斷抗原活性比較用傳統(tǒng)間接ELISA法[5]，用包被液(20 mmol/L Na2CO3,20 mmol/L NaHCO3,pH9.6)分別稀釋純化的FMDV AF/72株、Re-A/WH/09株純化的146S病毒抗原以及AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1表達蛋白至1 mg/L，按常規(guī)方法包被、封閉及干燥酶標板(表1)。將樣品稀釋液100 μL/孔加入酶標板中，再加Pc和Nc各10 μL/孔混勻，37℃保溫30 min，充分洗滌后每孔加入酶標抗體100 μL，37℃保溫30 min，充分洗滌后加入底物液顯色10 min，2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標儀讀D450值。計算2種抗原各自的Pc和Nc的值之比(P/N)，PcD450值均為0.4左右時，P/N值越高其反應(yīng)活性越好[6]。

表1 活性比較所用抗原組合列表

1.6 診斷抗原反應(yīng)性分析

1.6.1間接ELISA方法建立 將活性較高的幾株抗原分別用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到0.50 mg/L的質(zhì)量濃度后100 μL/孔包被酶標板，PBST洗滌6次，每次3 min(表2)。加入封閉液300 μL/孔，37℃封閉1 h后PBST洗滌同上。待檢血清、陽性和陰性對照血清按照1∶50稀釋，100 μL/孔，60 min后PBST洗滌同上。最適稀釋度的酶標二抗100 μL/孔，45 min后PBST洗滌同上。加入TMB底物顯色，100 μL/孔，10 min后加入終止液100 μL/孔終止反應(yīng)，酶標儀讀取D450值。判定標準：血清樣本抗體效價(S/P)=(D450值樣品-D450值陰性)/(D450值陽性-D450值陰性)，當效價≥0.30，判定為陽性；效價<0.25，判定為陰性。效價0.30～0.25判為可疑，2次可疑結(jié)果判定為陰性。

表2 反應(yīng)性分析所用抗原組合列表

1.6.2間接ELISA方法對不同抗原免疫反應(yīng)驗證 通過A型間接ELISA方法檢測100份FMDV 不同毒株疫苗免疫陽性血清、FMD O型、Asia1型陽性血清和陰性血清。根據(jù)陰、陽性檢出率確定不同毒株診斷抗原的免疫反應(yīng)性。

1.6.3GICA方法建立 按最適量分別向膠體金溶液中加入間接ELISA檢測結(jié)果中反應(yīng)性較高的AF/72株、Re-A/WH/09株純化146S病毒抗原，磁力攪拌15 min(表3)。再分別加入10%BSA至終濃度為1%，攪拌15 min后，移至離心管，經(jīng)8 000 r/min離心10 min，小心吸棄上清。將沉淀懸浮于1/10初始膠體金體積的金膠緩沖液中，即為免疫膠體金。將制備好的2種免疫膠體金分別用點噴儀設(shè)置工作噴涂量，并噴涂于玻璃纖維紙，制成金標墊。再用pH7.4 0.02 mol/L PB緩沖液分別將AF/72毒株和A/WH/09毒株的純化抗體及146S抗原調(diào)整至工作濃度，噴涂于NC膜作為試紙條C線和T線，置37℃烘干30 min。將2種金標墊與2種NC膜搭配，制備膠體金檢測試紙條。

表3 免疫層析檢測法建立所用抗原組合列表

1.6.4GICA方法對不同抗原免疫反應(yīng)驗證 通過2種免疫層析試紙條檢測100份FMDV 不同毒株疫苗免疫陽性血清、FMD O型、Asia1型陽性血清和陰性血清。根據(jù)陰、陽性檢出率確定不同毒株診斷抗原的免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09疫苗株抗原146S含量將D260>0.4的部分合并，即為合格的FMDV-146S抗原。根據(jù)公式146S(mg/L)=128.7×D259計算146S含量，結(jié)果可得AF/72株146S的含量為55.10 mg/L，Re-A/WH/09株146S的含量為48.32 mg/L。

2.2 AF/72株、A/WH/09株、A/GD/MM/13株病毒VP1蛋白鑒定結(jié)果對純化復(fù)性的3株FMDV蛋白VP1 進行Western blot 鑒定，均可見在目的大小處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶(圖1)，表明重組蛋白 pGEX-6p-1-VP1 能與豚鼠抗 A 型FMD 陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合，不能與豚鼠抗O型和Asia1FMD 病毒血清反應(yīng)，說明這3株VP1 蛋白都具有相對特異的生物活性。

M.蛋白Marker；1.VP1蛋白 SDS-PAGE；2.VP1蛋白Western blot

2.3 不同毒株抗原活性的比較應(yīng)用直接ELISA方法，用不同類型相同濃度的A型抗原包被ELISA板，再分別以抗 FMDV AF/72株、Re-A/WH/09株純化146S病毒抗原以及AF/72株、Re-A/WH/09株、A/GD/MM/13株VP1表達蛋白Ab為一抗，測定D450值，當陰性對照值<0.2、樣品P/N>2.10判定為陽性，而陽性的最高稀釋濃度判定為抗原與血清反應(yīng)作用效價(圖2)?？笰F/72株146S-Ab與其抗原反應(yīng)P/N為5.49，抗Re-A/WH/09株146S-Ab與其抗原反應(yīng)P/N為3.81，抗AF/72株VP1表達蛋白Ab與其抗原反應(yīng)P/N為2.86，抗Re-A/WH/09株VP1表達蛋白Ab與其抗原反應(yīng)P/N為2.21，抗A/GD/MM/13株VP1表達蛋白Ab與其抗原反應(yīng)P/N為1.95，可以看出A/GD/MM/13株抗原活性最低，不適合作為診斷抗原使用。

圖2 不同毒株抗原活性的比較分析

2.4 不同抗原建立間接ELISA方法檢測血清樣本試驗分析用純化AF/72株、Re-A/WH/09株146S抗原和VP1蛋白建立間接ELISA方法驗證100份檢測血清(圖3)。試驗發(fā)現(xiàn)a組和b組抗原包被酶標板用ELISA方法檢測100份田間血清時，對于不同毒株免疫的A型陽性血清其陽性檢出率分別為90.00%和86.67%；對于異型血清和陰性血清檢出率分別為95.00%和87.50%，檢測效果敏感性高，特異性好。c組和d組抗原包被酶標板檢測時敏感性與特異性均低于a組和b組，檢測效果不理想，不適合作為診斷用抗原。

圖3 不同抗原建立間接ELISA方法檢測結(jié)果比較

2.5 不同抗原建立GICA方法檢測血清樣本分析檢測100份血清樣本時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)a組試紙條檢測A型樣品呈明顯陽性結(jié)果，但檢測O型、Asia1型陽性血清時，會出現(xiàn)弱陽性結(jié)果，檢測效果不理想；b組試紙條檢測時與各類陽性血清時均發(fā)生陽性反應(yīng)，靈敏度和特異性無明顯差別；c組試紙條對于不同毒株免疫的A型陽性血清的敏感性為95.00%；對于異型血清和陰性血清的特異性為92.50%(圖4)，檢測效果敏感性高，特異性好；d組試紙條對于不同毒株免疫的A型陽性血清的敏感性為88.33%；對于異型血清和陰性血清的特異性為87.50%(圖4)，較c組試紙條靈敏度稍弱，特異性稍差，可以采用，但鑒于兩者在純化時，F(xiàn)MDV AF/72株抗原的收獲量較Re-A/WH/09株抗原的更多，濃度更高，因此選用AF/72株制備試紙條。

圖4 不同抗原建立GICA方法檢測結(jié)果比較

3 討論

測定血清中FMDV特異性抗體可用于檢測疫苗接種后的抗體水平，觀察免疫效果以及毒株之間的抗原性比較等方面[15-16]。已有資料顯示對FMDV疫苗免疫原性進行過研究，而對診斷用毒株之間抗原反應(yīng)性的比較尚未見到報道[17-18]。因此，根據(jù)FMDV流行情況，試驗設(shè)計將AF/72、Re-A/WH/09和A/GD/MM/13 3種毒株的全病毒抗原及其VP1表達蛋白作為備選抗原，最終篩選出AF/72株146S抗原具有最佳活性與反應(yīng)性。這與FMDV的結(jié)構(gòu)存在很大關(guān)系。FMDV的免疫原性主要取決于完整病毒粒子(146S)，它可誘導(dǎo)產(chǎn)生型特異性中和抗體[9]。而表達抗原多選用FMDV某一段基因序列。同時利用原核或真核系統(tǒng)表達，產(chǎn)生的蛋白與天然蛋白構(gòu)象差異很大，特別是抗原決定簇重要的糖基化位點不能得到很好的修飾，使其免疫原性較差，不能很好的產(chǎn)生中和抗體，這也是現(xiàn)在多數(shù)重組抗原不能替代全病毒抗原作為疫苗生產(chǎn)的原因[10]。而作為診斷動物免疫或感染產(chǎn)生中和抗體水平的檢測抗原，其必須具備充分的抗原決定簇和完整構(gòu)象位點才能更好的捕獲血清中的抗體，并與其進行特異性反應(yīng)，以提高其檢測的靈敏度[19-21]。同時，146S抗原作為純化天然病毒抗原，能提供表達抗原不具備的可針對病毒血清型特異性的位點[22]。因此，全病毒抗原有較好的反應(yīng)活性。

據(jù)文獻記載，從現(xiàn)有疫苗對流行毒株的保護性來看，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和國家FMD 參考實驗室聯(lián)合開展了A型AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株疫苗免疫攻毒試驗，結(jié)果表明2種疫苗均對當前流行的A型病毒有效[1]。從抗原活性與反應(yīng)性分析可以看到2種毒株各具有優(yōu)勢。AF/72具備良好的反應(yīng)性、特異性。Re-A/WH/09作為改造毒具有更為廣譜的反應(yīng)性，但使用時與O型陽性血清、Asia1型陽性血清有交叉反應(yīng)。作為診斷用抗原，需同時兼顧抗原反應(yīng)性與特異性，尤其是面對國內(nèi)市場O型流行情況復(fù)雜，O型疫苗類型多、接種區(qū)域普及率高，各級疫控免疫抗體檢測數(shù)量多的情況[23]。對于A型診斷抗原的選擇，應(yīng)具備較好的特異性，才能有效分析不同型疫苗對動物的保護情況，為防疫監(jiān)測提供正確的分析數(shù)據(jù)。

作為FMD的防控要求，以及病害的流行監(jiān)測，目前已經(jīng)建立了多種FMDV及其抗體的檢測方法。常用抗原檢測方法主要有病毒分離、PCR、抗原捕獲ELISA等。血清學診斷方面，現(xiàn)在檢測結(jié)構(gòu)蛋白抗體的方法主要是病毒中和試驗(VNT)、ELISA和GICA等[12]。其中ELISA方法更加特異、敏感、高效，大多數(shù)實驗室在前期研究中常用ELISA方法替代VNT方法。而GICA方法以其快速、簡便、適合大規(guī)模群體檢測等特點，成為FMD 診斷的最常用方法。本研究選擇AF/72毒株、Re-A/WH/09毒株純化146S抗原及其VP1表達蛋白、A/GD/MM/13毒株VP1表達蛋白作為備選診斷抗原，分別建立ELISA與GICA方法，根據(jù)對田間血清樣品的檢出率，分析抗原反應(yīng)性的高低。結(jié)果顯示純化的146S全病毒抗原在間接ELISA和GICA 2種方法中均表現(xiàn)出較高的敏感性與特異性，但對于不同毒株在純化過程中的收獲量及濃度有所不同。本試驗中AF/72株146S含量較Re-A/WH/09株146S高，且純化過程更簡單，將其作為診斷抗原的最佳備選所建立的診斷方法對預(yù)防和控制FMD 的發(fā)生及流行具有十分重要的意義。