商佳亮,騰召劍,陳立功,倪福太,宋勤葉*,周雙海 (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 07000;.吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,吉林 四平 36000;3.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 006)
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)可引起妊娠母豬厭食、發(fā)熱,懷孕后期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎兒或弱仔,仔豬和生長(zhǎng)肥育豬呼吸困難、間質(zhì)性肺炎以及免疫功能抑制等臨床癥狀與病理變化。該病毒是當(dāng)今危害全球養(yǎng)豬生產(chǎn)最重要的病原之一[1-4]。20世紀(jì)80年代中后期,PRRSV在北美洲和歐洲幾乎同時(shí)暴發(fā),隨后在世界各地相繼流行,1996年郭保清等[5]首次從我國(guó)豬場(chǎng)的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離鑒定到該病毒。自PRRSV暴發(fā)流行以來(lái),每年該病毒均給我國(guó)和世界其他國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)成員,是一種單股正鏈RNA病毒。依據(jù)病毒的核苷酸序列和血清學(xué)反應(yīng)特征,PRRSV可分為PRRSV-1型(歐洲型)和PRRSV-2型(北美洲型)兩個(gè)基因型,其中PRRSV-2型為我國(guó)流行的主要基因型[6-7]。PRRSV容易變異,從1995年我國(guó)首次暴發(fā)PRRSV至今,豬場(chǎng)流行的PRRSV毒株歷經(jīng)經(jīng)典毒株、高致病性毒株(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)及類(lèi)NADC30毒株的明顯變異[6,8-9]。目前豬場(chǎng)流行的PRRSV以類(lèi)NADC30毒株和HP-PRRSV毒株為主,經(jīng)典毒株在一些豬場(chǎng)零星散發(fā)[8,10-11]。對(duì)臨床PRRS疑似病例做出快速診斷、了解豬群的感染狀況對(duì)于PRRSV的有效防控具有重要意義。已有鑒別PRRSV經(jīng)典毒株、高致病性毒株或歐洲毒株的多重PCR方法[12-13],但尚未見(jiàn)到鑒別類(lèi)NADC30、高致病性與經(jīng)典PRRSV毒株的PCR檢測(cè)方法的研究報(bào)道。本研究建立了應(yīng)用1對(duì)引物即可鑒別PRRSV類(lèi)NADC30、高致病性與經(jīng)典毒株的PCR檢測(cè)方法,并進(jìn)行初步應(yīng)用,以期為臨床病例的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的檢測(cè)工具。
1.1 毒株與菌株高致病性PRRSV弱毒疫苗株JXA1購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司成都藥械廠;豬經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗株CH-1R購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;PRRSV類(lèi)NADC30毒株HBDZ2019、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定;豬瘟病毒(CSFV)弱毒疫苗株(細(xì)胞源)購(gòu)自遼寧益康生物股份有限公司;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所;大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 主要試劑病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒購(gòu)自深圳真瑞生物科技有限公司;2×Taq MasterMix(含染料)購(gòu)自北京康為試劑生物科技有限公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。
1.3 病料2017-2019年從河北保定、石家莊、邢臺(tái)、邯鄲等地采集的PRRSV感染患病豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織,共38份。
1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中公布的PRRSV經(jīng)典毒株(GenBank收錄號(hào):AY032626)、高致病性毒株(GenBank收錄號(hào):EF112445)與NADC30毒株(GenBank收錄號(hào):JN654459)的核苷酸序列,運(yùn)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)3條針對(duì)PRRSV ORF1a核苷酸序列的特異性引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 設(shè)計(jì)的PCR引物列表
1.5 病毒核酸提取與cDNA的合成根據(jù)病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒說(shuō)明,提取PRRSV CH-1R、JXA1-R和類(lèi)NADC30株細(xì)胞毒的RNA,然后按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明,將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程:在滅菌的無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管內(nèi)分別加入不同病毒的RNA 9 μL和隨機(jī)引物(25 pmol/L)1 μL,混勻,置71℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)5 min;取出離心管,立即冰浴5 min,瞬時(shí)離心,加入5 × 反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL、dNTP(10 mmol/L)4 μL、RNA 酶抑制劑(20 U)1 μL、M-MLV(200 U)1 μL,混勻,置37℃反轉(zhuǎn)錄1 h,70℃作用5 min后備用。
1.6 引物的篩選以PRRSV CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30株或3個(gè)毒株的核酸cDNA混合物為模板,分別用引物F1-R1或F1-R2進(jìn)行PCR。PCR體系為20 μL,包括2×Taq MasterMix 10 μL、上下游引物各0.5 μL(25 pmol/L)、模板2 μL與滅菌雙蒸水(ddH2O)7 μL,瞬時(shí)離心混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s,59℃ 1 min,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán)后72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,檢查不同引物的擴(kuò)增效率,篩選最佳引物。同時(shí)純化回收用所篩選引物擴(kuò)增的目的條帶,送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.7 退火溫度的優(yōu)化在不同退火溫度下,以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類(lèi)NADC30株的核酸cDNA為模板,用篩選的引物進(jìn)行梯度PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中各成分組成與1.6中所述的一致。梯度PCR參數(shù):94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s,58~62℃ 1 min,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸10 min。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,分析比較不同退火溫度下的PCR擴(kuò)增效率,確定最佳退火溫度。
1.8 引物含量的優(yōu)化將上、下游引物分別稀釋為40、30、20、10 pmol/L,然后以PRRSV CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30株以及三者的核酸cDNA混合物為模板,分別進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×Taq MasterMix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL與ddH2O 7 μL。擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s,58℃ 1 min,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃總延伸10 min。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,比較不同引物濃度下的PCR擴(kuò)增結(jié)果,確定最佳引物用量。
1.9 敏感性檢測(cè)將CH-1R(0.608 mg/L)、JXA1-R(6.93 mg/L)與類(lèi)NADC30(29.67 mg/L)毒株的cDNA混合,用ddH2O做101~106倍系列稀釋。以稀釋后的cDNA作為模板(2 μL/反應(yīng))進(jìn)行PCR,測(cè)定方法的敏感性。
1.10 特異性檢測(cè)提取PCV2、CSFV、PRV、PEDV、TGEV核酸,用建立的PCR方法檢測(cè),同時(shí)設(shè)立PRRSV CH-1R、JXA1-R和類(lèi)NADC30株以及三者的核酸cDNA混合物模板對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,判定方法的特異性。
1.11 臨床樣本檢測(cè)用建立的PCR方法檢測(cè)2017-2019年收集的38份臨床PRRSV感染病豬的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟等組織,分析不同毒株的感染情況。
2.1 引物的選擇分別以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類(lèi)NADC30毒株的核酸cDNA為模板,用引物F1-R1或F1-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果兩對(duì)引物均能針對(duì)毒株CH-1R、JXA1-R或類(lèi)NADC30擴(kuò)增出預(yù)期大小的核酸片段。序列測(cè)定顯示,各個(gè)片段的核酸序列與相應(yīng)參考毒株的序列一致。當(dāng)模板中同時(shí)含有PRRSV經(jīng)典、高致病性和類(lèi)NADC30毒株核酸時(shí),均可以同時(shí)擴(kuò)增出3個(gè)不同大小的DNA片段,但使用引物F1-R1進(jìn)行PCR時(shí),擴(kuò)增效率更高(圖1),故選擇F1-R1用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.DL100 DNA Ladder Marker;2~5.引物F1-R1,模板分別為毒株CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30及其核酸混合物;6~9.引物F1-R2,模板分別為毒株CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30及及其核酸混合物;10.水對(duì)照
2.2 確定退火溫度以PRRSV CH-1R、JXA1-R或類(lèi)NADC30株的核酸cDNA為模板,用引物F1-R1進(jìn)行梯度PCR。結(jié)果如圖2所示,退火溫度在58~62℃時(shí)能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶,但當(dāng)退火溫度在59.8~62℃時(shí),針對(duì)JXA1-R毒株的擴(kuò)增效率顯著下降;當(dāng)退火溫度高于60℃時(shí),針對(duì)CH-1R株和類(lèi)NADC30株的擴(kuò)增效率也明顯下降;因此,選擇58℃為該P(yáng)CR的退火溫度。
A.CH-1R株;B.JXA1-R株;C.類(lèi)NADC30株(1.DL100 DNA Ladder Marker;2~7.退火溫度分別為58.0、59.0、59.8、60.0、61.0和62.0℃)
2.3 確定引物含量當(dāng)上、下游引物濃度為20、30或40 pmol/L,即PCR反應(yīng)體系中引物含量為10、15或20 pmol時(shí),均能擴(kuò)增出針對(duì)CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30株的預(yù)期大小的DNA產(chǎn)物,擴(kuò)增效率高。但是當(dāng)引物濃度降低到10 pmol/L,即體系中引物含量為5 pmol時(shí),擴(kuò)增效率顯著下降(圖3),故將該P(yáng)CR擴(kuò)增體系中引物的最適含量為10 pmol。
1.DL100 DNA Ladder Marker;2~5、6~9、10~13、14~17.引物量分別為20、15、10和5 pmol,用每個(gè)引物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)的模板依次為PRRSV CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30毒株及其混合物
2.4 敏感性檢測(cè)將CH-1R株、JXA1-R株、類(lèi)NADC30毒株的cDNA混合模板系列稀釋后進(jìn)行PCR,結(jié)果如圖4所示,CH-1R株、JXA1-R株與類(lèi)NADC30株的cDNA最低檢出量分別為12.16、138.70和59.30 pg。
1.DL100 DNA Ladder Marker;2~7.模板稀釋101、102、103、104、105、106倍(2 μL/反應(yīng));CH-1R株、JXA1-R株和類(lèi)NADC30毒株的cDNA起始質(zhì)量濃度分別為0.608、6.930與29.670 mg/L
2.5 特異性檢測(cè)以PCV2、CSFV、PRV、PEDV、TGEV等病毒的核酸為模板,用建立的PCR方法檢測(cè),結(jié)果均沒(méi)有擴(kuò)增到預(yù)期大小的核酸產(chǎn)物(圖5),而單一PRRSV CH-1R、JXA1-R、類(lèi)NADC30毒株或三者核酸混合的模板均擴(kuò)增到了相應(yīng)目的片段,表明建立的方法具有很高的特異性。
1.DL100 DNA Ladder Marker;2.CH-1R;3.JXA1-R;4.類(lèi)NADC30;5.不同PRRSV毒株混合;6.PCV2;7.CSFV;8.PRV;9.PEDV;10.TGEV
2.6 臨床應(yīng)用用建立PCR檢測(cè)38份病料顯示,PRRSV全部陽(yáng)性,其中類(lèi)NADC30毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株的檢出率分別為89.5%(34/38)、26.3%(10/38)和7.9%(3/38);類(lèi)NADC30毒株與高致病性毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株以及類(lèi)NADC30毒株、高致病性毒株與經(jīng)典毒株混合感染的檢出率分別為18.4%(7/38)、7.9%(3/38)和2.6%(1/38)。該檢測(cè)結(jié)果表明,當(dāng)前河北省豬場(chǎng)類(lèi)NADC30毒株的感染率超過(guò)了高致病性毒株,成為當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢(shì)毒株,并且呈現(xiàn)在一個(gè)豬場(chǎng)內(nèi)同時(shí)有不同毒株流行的復(fù)雜感染狀態(tài)。
遺傳多樣性是PRRSV的主要特征,PRRSV-1型和PRRSV-2型在我國(guó)豬場(chǎng)均有流行,但各地流行的毒株以PRRSV-2型為主,1型主要處于零星散發(fā)狀態(tài)[7-8,11]。從1995年以來(lái),我國(guó)豬場(chǎng)流行PRRSV優(yōu)勢(shì)毒株經(jīng)歷了2次明顯變化,即2006年的第1次變化,經(jīng)典毒株(以CH-1a或BJ-4為代表毒株)的檢出率逐漸降低,取而代之的是高致病性毒株(以JXA1為代表毒株),該毒株引起20%~80%的生豬死亡[8-9];2013年的第2次變化,類(lèi)NADC30毒株暴發(fā),此后其在豬群中的感染率逐漸增加,目前在某些地區(qū)類(lèi)NADC30毒株已成為優(yōu)勢(shì)毒株,其次為HP-PRRSV,經(jīng)典毒株感染或與類(lèi)NADC30、HP-PRRSV毒株混合感染也時(shí)有發(fā)生[8-9,11]。豬場(chǎng)PRRSV感染的復(fù)雜性增加了臨床病例診斷和有效防控的困難。病毒分離鑒定、免疫組化、PCR等技術(shù)常用于PRRSV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或診斷,其中PCR具有敏感性高、操作簡(jiǎn)單、成本低、快捷等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于病原學(xué)的快速診斷與流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。因此,建立鑒別PRRSV經(jīng)典、高致病性與類(lèi)NADC30毒株的PCR方法,對(duì)于PRRSV感染的快速診斷及有效防控具有重要意義。
PRRSV基因變異表現(xiàn)為堿基的突變、置換、缺失、重組等多種形式,基因組中ORF1a、ORF3和ORF5是高變區(qū)[3,6-7]。PRRSV毒株的2次大的突變以O(shè)RF1a的Nsp2區(qū)域最顯著[3,15]。因此,本研究以O(shè)RF1a的Nsp2區(qū)域?yàn)榘谢?,通過(guò)比對(duì)經(jīng)典毒株、高致病性毒株與類(lèi)NADC30毒株的基因序列,設(shè)計(jì)合成PCR所需引物。引物設(shè)計(jì)思路與文獻(xiàn)[12-14,16]的思路相似,但本研究融入了對(duì)類(lèi)NADC30毒株的檢測(cè)。已知引物的特異性是決定PCR特異性與敏感性的重要因素。因此,本研究首先比較分析了2對(duì)引物的擴(kuò)增效率與特異性,篩選出1對(duì)最優(yōu)引物,進(jìn)而優(yōu)化了退火溫度。此外,由于試驗(yàn)中使用的是標(biāo)準(zhǔn)化的PCR反應(yīng)混合緩沖液,故本研究沒(méi)有對(duì)緩沖液成分及dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化,而是重點(diǎn)優(yōu)化了反應(yīng)體系中的引物含量。經(jīng)過(guò)對(duì)引物與退火溫度的優(yōu)化,該P(yáng)CR對(duì)3個(gè)毒株核酸cDNA的檢測(cè)敏感性均達(dá)到pg級(jí),對(duì)PCV2、CSFV、PRV等常見(jiàn)病毒沒(méi)有非特異性擴(kuò)增,說(shuō)明本研究中建立的PCR方法的敏感性和特異性均很高,并且反應(yīng)體系中只用到1對(duì)引物,即可同時(shí)鑒別檢測(cè)3個(gè)毒株,避免了引物之間的干擾,同時(shí)節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間與檢測(cè)成本。
為了評(píng)價(jià)方法的對(duì)臨床樣本的檢測(cè)效果,本試驗(yàn)用該P(yáng)CR方法檢測(cè)了2017—2019年間采集的已知PRRSV感染病豬的組織樣本,顯示類(lèi)NADC30毒株的檢出率最高,其次是高致病性毒株,而經(jīng)典毒株的檢出率很低,同時(shí)檢測(cè)到2個(gè)或3個(gè)不同毒株的混合感染病料。說(shuō)明類(lèi)NADC30毒株在河北省部分地區(qū)豬場(chǎng)已成為優(yōu)勢(shì)流行毒株,同時(shí)存在1個(gè)豬場(chǎng)內(nèi)同時(shí)流行不同毒株的復(fù)雜感染狀態(tài)。這些結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的流行情況基本相似[8,11],同時(shí)提示當(dāng)?shù)刎i場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PRRSV的防控力度,嚴(yán)格生物安全防控措施,以降低該病毒給豬場(chǎng)造成的經(jīng)濟(jì)損失。
總之,本研究建立的PCR方法能夠用1對(duì)引物同時(shí)檢測(cè)PRRSV經(jīng)典、高致病性和類(lèi)NADC30毒株。該方法不僅能夠用于臨床PRRSV感染的快速診斷,而且可以為PRRSV疫情監(jiān)測(cè)與預(yù)警以及流行病學(xué)調(diào)查提供重要技術(shù)支撐。