豬IL-10重組腺病毒的構建及其對PRRSV體外增殖的影響

魏婷婷，劉思穎，杜連昭，李 晨，王茜茜，馬 欣，王興龍 (西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱“豬藍耳病”，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染豬引起，自1987年被首次報道以來[1]給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失[1-3]。PRRSV基因型分為歐洲型(Ⅰ型)與美洲型(Ⅱ型)[4]2種，2種分型的PRRSV毒株感染后引起的臨床癥狀基本相同[5]。

我國主要流行Ⅱ型PRRSV毒株[6-8]，并于2006年自江西省開始出現(xiàn)[9-10]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)，該病被列為一類傳染病[11]。在我國PRRSV的地區(qū)性流行時有發(fā)生，減毒活疫苗在防控PRRS時起一定程度作用[12]，但PRRSV為RNA病毒，其基因組不斷地變異與重組產出新的強毒株，給疫苗防控帶來巨大的挑戰(zhàn)。PRRSV為套式病毒目、動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的一員[13]，與同屬的其他病毒有著相似的基因結構和復制方式[14]，且同樣主要感染巨噬細胞并在其中進行復制，造成感染后機體的免疫抑制與持續(xù)性感染，這一特征為其防控帶來阻礙，且其機理尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染豬后可誘導機體PBMC與PAM等細胞分泌IL-10使其表達上調，但被誘導的IL-10高表達對PRRSV感染機體的意義尚不明確。

IL-10細胞因子作為一個典型的免疫抑制因子，可能在PRRSV的感染過程中發(fā)揮主要作用。為探究IL-10對PRRSV在細胞內增殖的影響，本研究利用重組人腺病毒表達系統(tǒng)構建表達豬IL-10的重組腺病毒，以重組腺病毒感染的方式實現(xiàn)細胞內IL-10的過表達，并檢測過表達IL-10對PRRSV在體外細胞內增殖產生的影響，以期為后續(xù)體內試驗的進行提供技術支持，為進一步揭示IL-10于PRRSV感染的分子意義提供依據，從而給PRRSV的防控提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌種、細胞和質粒PRRSV SD16-GFP毒株由實驗室拯救并鑒定后保存，表達綠色熒光蛋白的rHAd-EGFP腺病毒、pAdTrack-cmv 與pAdEasy-1質粒、E.coliDH5α與BJ5183菌株、HEK-293A細胞、Marc-145細胞與3D4/21細胞均由本實驗室保存；含有豬IL-10全長基因序列的pET28a-IL-10質粒為實驗室鑒定后保存。

1.2 主要試劑抗PRRSV N蛋白鼠源多克隆抗體為自行制備保存；鼠源β-tubulin與TAGE標簽一抗購自天津三箭生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗鼠抗體購自生工生物工程股份有限公司；轉染試劑TurboFect Transfection Reagent、0.1% ATV、Opti-MEM與DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Scientific；胎牛血清(Sera Pro)、Trizol購自TaKaRa;DEPC水與分析純購自索萊寶；膠回收試劑盒與RNA反轉試劑盒、DNA與蛋白Marker購自GenStar；連接試劑盒、DNA聚合酶(TaKaRa);質粒提取試劑盒購自天根生物公司；限制性內切酶，NEB產品。

1.3 引物設計與合成根據GenBank存錄序列，分別設計擴增IL-10全長的上下游引物IL-10-1s、IL-10-1a與qPCR引物、PRRSV ORF7及對照qPCR引物、IL-10檢測引物(表1)。引物均由擎科生物公司合成。

表1 引物序列

1.4 穿梭質粒pAdTrack-cmv-IL-10的構建以實驗室保存的pET28a-IL-10質粒為模板，使用IL-10-1s與IL-10-1a進行PCR擴增獲得豬IL-10基因。利用BglⅡ和NotⅠ酶切位點連入pAdTack-cmv載體后轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細菌，篩選出陽性重組質粒并進行BglⅡ和NotⅠ雙酶切與基因測序鑒定。

1.5 重組腺病毒質粒pAd-IL-10的構建使用EcoRⅠ限制性內切酶將1 μg pAdTrack-cmv-IL-10質粒線性化后轉化含pAdEasy-1腺病毒骨架載體的BJ5183感受態(tài)細菌，使兩者完成同源重組。篩選出陽性重組菌落并進行酶切與測序鑒定，大量擴增pAd-IL-10重組質粒后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 rHAd-IL-10重組腺病毒的包裝將PacⅠ限制性內切酶線性化的pAd-IL-10腺病毒重組質粒轉染HEK-293A細胞六孔板(4 μg/孔)，次日更換含2% FBS的細胞維持液培養(yǎng)10～14 d。

在顯微鏡下觀察轉染后的細胞，當出現(xiàn)拉絲、空洞等特征性的細胞病變后，收集病毒液按500 μL/孔的量轉接新的HEK-293A細胞6孔板中培養(yǎng)2～3 d，使用熒光電子顯微鏡觀察GFP表達情況，并觀察細胞的病變情況，收集病毒液。

1.7 重組腺病毒的TCID50測定將rHAd-EGFP、rHAd-IL-10病毒液使用純DMEM培養(yǎng)液進行10-2～10-12的10倍倍比稀釋，每個稀釋度8個重復孔。于預備HEK-293A細胞的96孔板中每孔加入100 μL稀釋好的病毒液孵育1 h后更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，統(tǒng)計產生CPE的細胞孔數，按照Karber法進行計算。

1.8 Western blot檢測IL-10的表達將10 MOI rHAd-IL-10與rHAd-EGFP病毒分別接入3D4/21細胞24孔板中，培養(yǎng)48 h后收集細胞樣品進行Western blot檢測。一抗為鼠源抗FLAG或β-tubulin標簽抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠二抗。用ECL化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測目的蛋白(23 kDa)與β-tubulin蛋白(55 kDa)條帶。

1.9 豬IL-10的活性驗證據文獻報道，IL-10可以抑制LPS對單核巨噬細胞產生IL-12的誘導作用[15]。試驗使用質量濃度為 1 mg/L的LPS誘導3D4/21細胞產生IL-12后，再利用RT-qPCR技術測定分別感染rHAd-IL-10、rHAd-EGFP病毒36 h后的3D4/21細胞中IL-12 mRNA表達量的差異，從而驗證rHAd-IL-10重組腺病毒表達的豬IL-10的活性。

1.10 IL-10對PRRSV增殖的影響使用10 MOI rHAd-IL-10病毒提前感染Marc-145細胞(24孔板)實現(xiàn)豬IL-10的過表達，設感染rHAd-EGFP病毒為對照組，培養(yǎng)24 h后每孔分別加入1 MOI PRRSV SD16-GFP病毒，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后收樣，分別進行RT-qPCR、Western blot與TCID50檢測。

2 結果

2.1 穿梭質粒pAdTrack-cmv-IL-10的構建將IL-10基因(573 bp)(圖1A)連入pAdTack-cmv載體獲得穿梭質粒pAdTrack-cmv-IL-10(圖1B)，經BglⅡ與NotⅠ酶雙酶切鑒定(載體約9 200 bp、目的片段約560 bp)(圖1C)均正確后，送至西安擎科生物公司進行測序鑒定，結果符合。

M.DNA Maker；A.IL-10目的片段擴增；B.質粒pAdTrack-cmv-IL-10電泳；C.質粒pAdTrack-cmv-IL-10雙酶切鑒定

2.2 重組腺病毒質粒pAd-IL-10的構建線性化的 pAdTrack-cmv-IL-10質粒(圖2A)轉化含pAd-Easy-1的BJ5183菌后獲得pAd-IL-10重組質粒(約35 000 bp)(圖2B)。

A.pAdTrack-cmv-IL-10質粒EcoRⅠ酶切結果(1.pAdTrack-cmv-IL-10質粒);B.pAd-IL-10質粒電泳結果(1.pAdTrack-cmv-IL-10質粒對照;2.pAd-IL-10質粒);C.pAd-IL-10 PacⅠ酶切(1.pAdTrack-cmv-IL-10質粒酶切對照;2.pAd-IL-10質粒酶切產物);M.DNA Marker

2.3 rHAd-IL-10重組腺病毒的包裝使用PacⅠ將pAd-IL-10質粒線性化得到大小約5 000、30 000 bp的2條條帶(圖2C)，轉染HEK-293A細胞后12 d左右在顯微鏡下觀察到細胞病變(圖3A)，收集病毒液轉接新的HEK-293A細胞，72 h后使用熒光電子顯微鏡觀察到大量GFP表達(圖3B)。

A.pAd-IL-10腺病毒重組質粒轉染HEK-293A細胞后細胞病變圖；B.rHAd-IL-10重組腺病毒感染HEK-293A細胞熒光圖

2.4 重組腺病毒的TCID50測定按照Karber法進行計算，得出rHAd-EGFP重組腺病毒的TCID50為10-9.87/mL，rHAd-IL-10重組腺病毒的TCID50為10-10.25/mL。

2.5 Western blot檢測IL-10的表達rHAd-IL-10重組腺病毒感染3D4/21細胞后成功表達IL-10(23 kDa)，對照組成立(圖4A)。

2.6 豬IL-10活性驗證感染rHAd-IL-10重組腺病毒的3D4/21細胞中IL-12 mRNA表達量相比rHAd-EGFP對照組顯著降低約40%(P<0.01)(圖4B)，即rHAd-IL-10重組腺病毒表達的豬IL-10具有相應的生物活性。

A.Western blot 檢測IL-10；B.RT-qPCR檢測IL-12 mRNA

2.7 IL-10對PRRSV增殖的影響

2.7.1RT-qPCR檢測PRRSV mRNA水平 Marc-145細胞分別經rHAd-EGFP(對照組)和 rHAd-IL-10感染24 h后接入PRRSV SD16-GFP病毒，培養(yǎng)24、48 h后收取細胞樣品，RT-qPCR檢測2組細胞RNA中PRRSV ORF7轉錄mRNA的量。結果如圖5A所示，使用rHAd-IL-10重組腺病毒過表達豬IL-10的細胞組檢測到PRRSV ORF7轉錄mRNA的量顯著增多(P<0.01)，在24、48 h分別約為對照組的1.6和2.3倍，說明過表達豬IL-10促進PRRSV病毒在Marc-145細胞內的轉錄水平，即促進病毒增殖。

2.7.2Western blot檢測PRRSV N蛋白的表達 Marc-145分別經rHAd-EGFP(對照組)、rHAd-IL-10重組腺病毒感染24 h后接入PRRSV SD16-GFP病毒，培養(yǎng)48 h后收取細胞樣品，Western blot檢測2組細胞中PRRSV N蛋白的量，使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析后，結果顯示經rHAd-IL-10重組腺病毒過表達豬IL-10的細胞中N蛋白的表達量相比對照組顯著增多(P<0.01)(圖5C)，約為對照組的1.2倍，這一結果證明豬IL-10可以促進PRRSV SD16-GFP病毒在Marc-145細胞內的增殖(圖5)。

A.RT-qPCR檢測IL-10對Marc-145細胞中PRRSV mRNA水平的影響；B.Western blot檢測Marc-145細胞中PRRSV蛋白表達水平；C.蛋白灰度分析

2.7.3PRRSV的TCID50測定 經處理后的Marc-145細胞上清液轉接新的Marc-145細胞96孔板后進行TCID50檢測，4～5 d后統(tǒng)計產生CPE的細胞孔數，按照Karber法計算各組的病毒滴度得出rHAd-EGFP和rHAd-IL-10處理后的PRRSV病毒TCID503次試驗平均值分別為10-4.42/mL和10-5.14/mL。轉換為PFU后，rHAd-IL-10處理組的PRRSV SD16-GFP病毒滴度顯著高于rHAd-EGFP處理的對照組(P<0.01)，證明豬IL-10表達上調可以促進PRRSV SD16-GFP病毒在Marc-145細胞內的增殖(圖6)。

圖6 TCID50檢測IL-10對Marc-145細胞中PRRSV病毒滴度的影響

3 討論

PRRSV通過感染PAM細胞進入豬體內后，能通過不斷地在細胞內復制實現(xiàn)持續(xù)性感染，而長期在豬體內存在，在感染后易引發(fā)與其他細菌或病毒病的混合性感染[16-19]，造成這一現(xiàn)象的機制尚不明確[20]。此外，PRRSV的感染影響豬瘟疫苗免疫后機體產生豬瘟抗體[21-23]，這一影響很可能由PRRSV造成的免疫抑制引起。PRRSV病毒粒子在感染機體后的前期與后期均會誘導一系列細胞因子的表達水平產生相應變化，例如IL-10、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-15等[24-26]，它們的產生和分泌與機體的免疫應答息息相關。在這些細胞因子中，IL-10作為典型的免疫抑制因子，在PRRSV毒株感染豬后會引起其水平持續(xù)上升[27]，但是這種高表達現(xiàn)象對PRRSV感染的意義何在仍無定論。

本研究選用重組腺病毒載體來實現(xiàn)IL-10的表達調控，為后續(xù)的多種細胞試驗及動物試驗的簡便性與安全性奠定了基礎。試驗結果表明，獲得的rHAd-IL-10重組腺病毒感染3D4/21細胞后可以抑制LPS誘導的IL-12細胞因子的表達與分泌，這一結果與已有研究發(fā)現(xiàn)相吻合[15]。IL-12細胞因子參與促進細胞免疫應答調控，可誘導相應的免疫細胞產生IFN-γ，提升機體的抗病毒作用。IL-10的這種抑制作用可能是導致機體感染 PRRSV后出現(xiàn)免疫抑制的重要原因之一。

研究還證實IL-10在細胞內表達水平上調后會促進PRRSV SD16-GFP病毒在Marc-145細胞內的增殖，這為構建用于病毒擴增的細胞系提供理論支持。此外，推測這一促進作用與PRRSV感染機體后易誘發(fā)混合感染可能存在聯(lián)系，已有試驗表明IL-10水平降低可抑制豬瘟病毒在體內的復制[28]，IL-10的高表達對病毒增殖的促進作用可能是導致混合感染的重要原因，這有利于臨床防控，但其中可能存在更復雜的機制，還需要進行更深入的研究。