豬瘟、非洲豬瘟和豬水泡病毒多重?zé)晒釸T-PCR同步檢測和鑒別診斷方法的建立及應(yīng)用

史喜菊，劉艷華，馬貴平，李炎鑫，劉全國，賴平安，高志強(qiáng)，徐立偉 (北京海關(guān)，北京 100026)

我國自2018年發(fā)生非洲豬瘟疫情后，對活豬和豬肉制品的進(jìn)口量劇增，為了保障進(jìn)出口產(chǎn)品的安全性，出入境的活豬和豬肉制品都要經(jīng)過嚴(yán)格檢疫。目前檢疫的主要豬病都是對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大、OIE重點(diǎn)關(guān)注、世界各國重點(diǎn)防控的疫病[1-3]?，F(xiàn)有檢測方法基本還是針對單個病原的單一檢測，會造成漏檢。而且，進(jìn)境動物經(jīng)過長途運(yùn)輸后，在隔離檢疫期間可能會出現(xiàn)一些臨床疾病，很多病原都可以引起相似的臨床癥狀，現(xiàn)有單一檢測技術(shù)難以全面、真實地反映畜禽感染狀態(tài)和發(fā)病死亡原因[1-2]。因此，建立可同時檢測多重疾病的多重檢測技術(shù)一直是口岸和各級獸醫(yī)衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)研究工作的重點(diǎn)。本試驗是在前期建立的多病原同步檢測技術(shù)基礎(chǔ)上[2-4]，進(jìn)一步以古典豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)和豬水泡病病毒(swine vesicular disease virus，SVDV)為研究對象[2,5-10]，建立了可用于這3種病毒混合感染檢測和鑒別診斷的多重?zé)晒釶CR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料CSFV、ASFV和SVDV陽性質(zhì)控品均為本實驗室制備并保存的體外反轉(zhuǎn)錄cRNA或者重組質(zhì)粒[2-3,9]。測試所用的CSFV、ASFV及豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流感病毒(SIV)、O型口蹄疫滅活病毒(FMDV)和水泡性口炎病毒(VSV)均為本實驗室制備的核酸樣質(zhì)控品[3]和檢測留樣。

1.2 試劑克隆載體和體外轉(zhuǎn)錄試劑均為Promega公司產(chǎn)品;Ex-Taq PCR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品;Path-IDTMMultiplex one-step RT-PCR Kit為AB公司產(chǎn)品；TIANamp Virus DNA/RNA Kit為天根生化公司產(chǎn)品；探針、引物由TaKaRa(大連寶生物)公司合成。

1.3 引物和探針設(shè)計與合成下載GenBank中現(xiàn)有CSFV、ASFV和SVDV所有分離株基因，使用CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析軟件進(jìn)行多重比較，分別選取CSFV的5′UTR基因片段、ASFV的VP72基因片段和SVDV的5′UTR基因片段作為擴(kuò)增靶基因，根據(jù)多重?zé)晒釸T-PCR特點(diǎn)分別設(shè)計并篩選出能覆蓋大部分分離株、又適合多重檢測并可以區(qū)分的引物和探針(表1)。引物和探針均由TaKaRa(大連寶生物)合成，用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲藏液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系將引物和探針儲備液按照引物終濃度400 nmol/L和探針終濃度200 nmol/L的要求分別進(jìn)行10倍稀釋和混合，引物混合液包括5條CSFV引物、5條ASFV引物和2條SVDV引物共12條，探針混合液包括2條CSFV探針、1條ASFV探針和1條SVDV探針共4條(表1)，按照表2配制反應(yīng)體系，將混合液充分混合后，最后加入模板，簡短離心，按照表3的反應(yīng)程序進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，所用設(shè)備為BioRad公司的CFX-96。

表1 CSFV、ASFV和SVDV的一步法多重?zé)晒釸T-PCR檢測引物

表2 一步法多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系

表3 一步法多重?zé)晒釶CR反應(yīng)程序

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和最低檢測限的確定分別將已知濃度的CSFV、ASFV和SVDV陽性質(zhì)控品進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)，用模板濃度對數(shù)與對應(yīng)的熒光Ct值做單重?zé)晒釸T-PCR濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測出的Ct值所對應(yīng)的濃度即為單重?zé)晒釸T-PCR最低檢測限。

再將已知濃度的CSFV、ASFV和SVDV陽性質(zhì)控品等量混合后，進(jìn)行10倍梯度稀釋進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)，按1.6步驟檢測最低檢測限。

1.7 特異性測試選擇實驗室制備的8種豬病毒質(zhì)控品(表4)，分別用CSFV、ASFV和SVDV的引物和探針進(jìn)行單重?zé)晒釸T-PCR，驗證引物和探針的特異性；用建立的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系對表4中的8種病毒質(zhì)控品進(jìn)行檢測，驗證引物和探針混合后多重反應(yīng)體系的特異性。

表4 特異性試驗用到的病毒質(zhì)控品

1.8 多重?zé)晒釸T-PCR和單重?zé)晒釸T-PCR的比較將CSFV、ASFV和SVDV陽性質(zhì)控品等量混合后進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR和CSFV、ASFV和SVDV單重?zé)晒釸T-PCR，將相同濃度模板對應(yīng)的熒光Ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，比較多重?zé)晒釸T-PCR和各單重?zé)晒釸T-PCR的符合性。

1.9 樣品驗證和測試建立的多重?zé)晒釸T-PCR測試中國獸藥監(jiān)察所豬瘟參考實驗室提供的CSFV核酸20份，委托美國農(nóng)業(yè)部外來動物疫病中心(USDA)測試了ASFV毒株5株、各3個濃度梯度，與中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心非洲豬瘟參考實驗室進(jìn)行10份陽性樣品測試比對。對實驗室近2年收集的200份血液及300份肉制品提取病毒總核酸進(jìn)行臨床樣品驗證，并與單重?zé)晒釸T-PCR進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)控品定量結(jié)果將制備好的陽性質(zhì)控品，分別用紫外分光儀測定其D260和D280值并計算出質(zhì)?？截悢?shù)(表5)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限分別用CSFV、ASFV和SVDV質(zhì)控品做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線PCR擴(kuò)增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴(kuò)增效率良好。將模板進(jìn)行10-11稀釋仍能檢測到熒光信號，根據(jù)表5濃度，計算出對應(yīng)的最低檢測限為8.8～13.0拷貝/μL。

表5 陽性質(zhì)控品濃度測定

圖1 熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 A.CSFV；B.ASFV;C.SVDV

CSFV、ASFV和SVDV混合質(zhì)控品做多重?zé)晒釸T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖2可以看出，多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增效率E值分別為103、107和110，R2值分別為0.984、0.986和0.989，曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴(kuò)增效率并沒有受到多重干擾。相同稀釋倍數(shù)對應(yīng)的Ct值比單重?zé)晒釸T-PCR略有升高，但不構(gòu)成顯著性差異，最低檢測限仍然可達(dá)10拷貝/μL。

圖2 CSFV、ASFV和SVDV多重?zé)晒釸T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性檢測結(jié)果單個病毒的引物和探針只能擴(kuò)增出各自的病毒核酸，其他病毒模板擴(kuò)增均為陰性，表明所設(shè)計的引物和探針特異性良好。利用建立的多重?zé)晒釸T-PCR方法對表4中的病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果僅CSFV、ASFV和SVDV有擴(kuò)增曲線，其他病毒均無特異性擴(kuò)增信號，表明所建立的方法特異性良好，多重并沒有對特異性產(chǎn)生干擾。

2.4 多重?zé)晒釸T-PCR和單重?zé)晒釸T-PCR的比較利用相同濃度的混合模板同時進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR和單重?zé)晒釸T-PCR的符合性測試，回歸方程計算結(jié)果表明，CSFV、ASFV和SVDV單重?zé)晒釸T-PCR與多重?zé)晒釸T-PCR的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.9988、0.9978和0.9976，說明多重?zé)晒釸T-PCR和各單重?zé)晒釸T-PCR的符合性良好，對于相同濃度的模板，其Ct值基本一致，所有引物和探針放在一個反應(yīng)體系混合后并沒有相互干擾(圖3)。

圖3 多重?zé)晒釸T-PCR與單重?zé)晒釸T-PCR的比較

2.5 樣品驗證結(jié)果本研究建立的多重?zé)晒釸T-PCR對國家豬瘟參考實驗室提供的20份陽性樣品進(jìn)行測試，100%符合。本檢測方法經(jīng)USDA測試，5株ASFV毒株各3個濃度梯度，結(jié)果全部陽性；本實驗室檢測出的10份陽性樣品經(jīng)與國家非洲豬瘟參考實驗室檢測，結(jié)果全部一致。從200份血液中檢測出ASFV陽性8份，從300份肉制品中檢測出ASFV陽性10份，CSFV和SVDV檢測均是陰性，與單重?zé)晒釸T-PCR檢測結(jié)果一致，沒有檢測到混合感染。

3 討論

針對單個病原檢測的熒光PCR技術(shù)目前已相當(dāng)成熟，廣泛用于動物疫病檢測領(lǐng)域[9,11]，但是對于多重?zé)晒釶CR，由于對引物和探針設(shè)計的技術(shù)要求很高，目前并沒有成熟的方法可用。有很多學(xué)者已建立多種普通多重PCR檢測法[12]，而敏感性顯然不能滿足篩選試驗的要求[1,4,10,13-14]，也有研究建立多重?zé)晒釶CR，但敏感性和特異性沒有達(dá)到預(yù)期[8,13-17]。本研究針對目前單一病原檢測方法的不足，建立了CSFV、ASFV和SVDV 3種病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR檢測和鑒別方法。

現(xiàn)有熒光PCR大多是1個靶基因設(shè)計1對引物和1個探針，病毒靶基因經(jīng)常容易發(fā)生變異，需要不斷更新引物和探針序列。本研究設(shè)計引物和探針時針對現(xiàn)有CSFV和ASFV序列，分別設(shè)計5條引物，基本可以覆蓋現(xiàn)有CSFV和ASFV分離株，針對CSFV還設(shè)計了2個探針，更增加了方法兼容性和涵蓋性。但是在同一個反應(yīng)體系中混合多條引物和探針，互相之間的干擾又是一個難題，本研究從設(shè)計的眾多序列中進(jìn)行配對篩選，經(jīng)過RNA-RNA引物二級結(jié)構(gòu)等測試和篩選，最終選擇了上述序列。

通過濃度熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看到，不論是單重?zé)晒釸T-PCR還是多重?zé)晒釸T-PCR，其標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示PCR擴(kuò)增效率E值均在正常范圍，R2>0.98,曲線斜率也正常，說明擴(kuò)增效率很高，體系中各成分濃度搭配恰當(dāng)。

敏感性測試結(jié)果表明，與各病原單重?zé)晒釸T-PCR相比，對于相同濃度的模板，多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增所得Ct值略有升高，但差異不顯著，計算所得最低檢測限仍然可達(dá)10拷貝/μL，與之前的熒光PCR技術(shù)的敏感性指標(biāo)一致[2,17-18]。

特異性測試結(jié)果表明，本研究建立的多重?zé)晒釸T-PCR引物和探針特異性均為100%，不管是單病原模板，還是3個病原混合模板，單特異性引物和探針和多重混合引物和探針均只能擴(kuò)增出自己的目標(biāo)病原。而且，用實驗室建立的其他8種豬病毒陽性質(zhì)控品測試，均未見任何非特異性擴(kuò)增。說明上述設(shè)計的15條引物和4個探針放在同一個多重反應(yīng)體系并沒有產(chǎn)生干擾，特異性很強(qiáng)，克服了多重PCR的固有不足[12]。

多重?zé)晒釸T-PCR與單重?zé)晒釸T-PCR比較分析表明，對于同一濃度模板，多重?zé)晒釸T-PCR分別與各自單重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增得到的Ct值相關(guān)性非常高，R2均大于0.99，再次證明了引物和探針的混合并沒有產(chǎn)生相互干擾，沒有影響擴(kuò)增效率。據(jù)報道，三重?zé)晒釶CR可以達(dá)到與單重?zé)晒釶CR相等的指標(biāo)參數(shù)，但是四重以后敏感性和特異性均會受到不同程度的影響[2，12,17]。本研究也曾嘗試加入第4種病原，四重?zé)晒釸T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線指標(biāo)參數(shù)很難都落在合理范圍內(nèi)(未公開發(fā)表)，說明產(chǎn)生了干擾，敏感性會降低。

在方法驗證過程中，本研究建立的多重?zé)晒釸T-PCR方法用國家豬瘟參考實驗室提供的20份CSFV核酸樣品進(jìn)行驗證，100%符合。USDA測試的樣品包括5株ASFV毒株，每個毒株設(shè)了3個不同濃度梯度，結(jié)果均為陽性。本次檢測的10份陽性樣品送到國家非洲豬瘟參考實驗室確診，結(jié)果完全相同。在臨床樣品測試中，分別使用了200份血液和300份豬肉制品，篩選出ASFV陽性樣品8份(8/200)和10份(10/300)，這與前2年我國ASF疫情暴發(fā)有關(guān)，有的動物也許處于隱性感染或者康復(fù)帶毒狀態(tài)。CSFV和ASFV臨床癥狀相似，在感染野豬群中也發(fā)現(xiàn)了2種病原可以共存[6]，但本研究沒有檢測到共感染樣品。一方面說明CSFV得到了很好的控制，另一方面可能也與采樣部位有關(guān)，CSFV常見于各種淋巴組織和處于病毒血癥期的血液中[6,11,13]，而SVDV很多年在我國并未見報道。