“消癖煎”對乳腺增生模型大鼠的治療作用及其機理研究

汪 怡 蔣潔君 李青松

（昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇昆山215300）

乳腺增生好發(fā)于25～45歲女性，是育齡期婦女最常見的乳房良性疾病，其發(fā)病率占乳腺疾病的首位[1]。有文獻報道，乳腺增生是乳腺癌發(fā)病的危險因素[2]。目前，對于乳腺增生的病因及發(fā)病機制尚不明確?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為本病的發(fā)生與卵巢內(nèi)分泌失調(diào)關(guān)系密切，西醫(yī)采用激素類藥物緩解乳腺增生癥狀，但往往伴隨著許多副作用和嚴重并發(fā)癥，不適合長期治療，外科手術(shù)也很難被多數(shù)人接受，且術(shù)后易復(fù)發(fā)[3]。中醫(yī)藥能有效治療乳腺增生[4-6]，且毒副作用較小。消癖煎是昆山市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)中藥制劑，具有活血祛瘀、疏肝理氣之功效，多年來用于治療乳腺增生具有良好的臨床療效。本實驗制備大鼠乳腺增生模型，觀察消癖煎對模型大鼠乳腺組織病理和血清性激素等的影響，探索消癖煎治療乳腺增生的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級Wistar雌性未孕大鼠，體重180～200 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2019-0001。

1.2 藥品與試劑 消癖煎（昆山市中醫(yī)醫(yī)院制劑生產(chǎn)研發(fā)中心自制，按制劑處方取柴胡、赤芍、白芍、生山楂、橘葉、橘核、黃藥子、路路通、紫蘇梗、浙貝母、白芥子、夏枯草各10 g，當歸、全瓜蔞、香附、牡丹皮各12 g，枳實、枳殼各8 g，生牡蠣、石見穿、生麥芽各15 g，青皮5 g，川芎、生甘草各6 g，加約8倍量水浸泡2 h后煎煮2 h，濾出藥液后再加5倍量水煎煮1 h，合并2次藥液，濃縮后加入適量95%乙醇至約60%醇濃度，充分攪拌，靜置過夜，再濾出上清液，回收乙醇，加純水制成含生藥0.984 g/mL的浸提液，-4 ℃保存?zhèn)溆茫?。苯甲酸雌二醇注射液（杭州動物藥品廠，批號180429），黃體酮注射液（浙江仙琚藥業(yè)，批號180107），枸櫞酸他莫昔芬片（揚子江藥業(yè)，批號18122412）。血清雌二醇（E2）放免試劑盒、血清孕酮（P）放免試劑盒、血清垂體泌乳素（PRL）放免試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號20190828）；蘇木精、伊紅（上海麥克林生化科技有限公司），其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 游標卡尺（上海匯一尺業(yè)有限公司），XH-6020型全自動放免計數(shù)儀（西安核儀 器 廠），2235型 輪 轉(zhuǎn) 切 片 機（德 國Leica公 司），AUTOSTAINER XL全自動染色機（德國Leica公司），EC350-1冷熱臺包埋機（德國Microm公司），ASP300S全自動生物組織脫水機（德國Leica公司），TEC2500病理組織烘漂儀（常州郝思琳醫(yī)用儀器公司），CX41生物顯微鏡（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社），DP72顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社）。

2 實驗方法

2.1 造模 參考《乳腺增生動物模型制備規(guī)范（草案）》[7]制備乳腺增生大鼠模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取部分作為造模組進行造模，肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/（kg·d），連續(xù)25 d，隨后肌肉注射黃體酮注射液4 mg/（kg·d），連續(xù)5 d。另選取部分大鼠作為空白對照組，同法肌肉注射等量生理鹽水，連續(xù)30 d。各組分別取3只大鼠，光鏡下對比乳腺組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)，確定造模成功。

2.2 分組與給藥 將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、陽性藥物組和消癖煎高、中、低劑量組，每組10只。陽性藥物組按1.8 mg/（kg·d）給予枸櫞酸他莫昔芬，消癖煎高、中、低劑量組給藥劑量分別為2.65 g/（kg·d）、5.30 g/（kg·d）、10.60 g/（kg·d），另取空白對照組10只和模型對照組分別給予同體積生理鹽水，各組均灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)30 d。

2.3 指標觀察

2.3.1 乳頭直徑和高度 各組大鼠末次給藥24 h后，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，水平仰臥位，將第二對乳頭周圍充分脫毛，擦拭干凈，用游標卡尺精密測量第二對乳頭的直徑和高度。

2.3.2 血清激素水平 各組大鼠麻醉后，腹主動脈取血約5 mL，離心半徑10 cm、3000 r/min高速冷凍離心15 min，取上層血清，放射免疫法測定E2、P和PRL含量。

2.3.3 乳腺組織病理形態(tài) 各組大鼠腹主動脈取血后處死，取下第二對完整的乳房，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片（4 μm），HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺組織的結(jié)構(gòu)及形態(tài)，對乳腺小葉、腺泡等計數(shù)，按文獻[8]中的標準對乳腺增生情況進行評級，評級標準見表1。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件-對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（x± s）表示，各組數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，組間比較采用獨立樣本t檢驗；等級資料采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠乳頭直徑和高度比較 結(jié)果見表2。

3.2 各組大鼠血清E2、P、PRL水平比較 結(jié)果見表3。

3.3 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)比較 光鏡下，空白對照組大鼠乳腺組織基本無增生現(xiàn)象。與空白對照組比較，模型對照組大鼠乳腺組織出現(xiàn)乳腺小葉體積增大，腺泡數(shù)量增多，腺泡和導(dǎo)管明顯擴張，腺泡腔及導(dǎo)管內(nèi)可見大量分泌物，腺泡上皮出現(xiàn)增生等明顯的病理變化，乳腺增生病理分級趨向嚴重。與模型對照組比較，各給藥組大鼠乳腺增生情況得到改善，腺泡數(shù)目減少，腺泡開始萎縮，腔內(nèi)分泌物亦減少，乳腺增生病理分級亦有不同程度減輕。結(jié)果見圖1、表4。

4 討論

乳腺增生可歸屬于中醫(yī)學(xué)“乳癖”范疇，始見于《中藏經(jīng)》，龔居中《外科活人定本》首次將乳癖與乳房腫塊聯(lián)系在一起，并為乳癖設(shè)立了獨立篇章，曰：“乳癖，此癥生于正乳之上，乃厥陰、陽明之經(jīng)所屬也……何謂之癖，若硬而不痛，如頑核之類?！敝嗅t(yī)學(xué)認為乳腺增生是由于郁怒傷肝、思慮傷脾、氣滯血瘀、痰凝成核所致，治以活血散瘀、疏肝理氣[9]。消癖煎是我院乳腺外科專家經(jīng)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)開發(fā)的中藥復(fù)方院內(nèi)制劑，方中柴胡、青皮、香附、全瓜蔞疏肝理氣、調(diào)理沖任；川芎并合當歸活血化瘀止痛；夏枯草、貝母化痰解郁；白芍、甘草酸甘化陰、柔肝平肝[10]。全方共奏疏肝理氣、活血祛瘀之效，藥證合拍。

表1 大鼠乳腺增生評級標準

表2 各組大鼠乳頭直徑和高度比較（±s）

表2 各組大鼠乳頭直徑和高度比較（±s）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性藥物組比較，☆P＜0.05；與消癖煎高劑量組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 乳頭直徑/mm 乳頭高度/mm空白對照組 10 0.93±0.07 1.14±0.12模型對照組 10 1.40±0.25* 1.77±0.20*陽性藥物組 10 1.07±0.13*# 1.31±0.16*#消癖煎低劑量組 10 1.33±0.20*☆△ 1.64±0.16*☆△消癖煎中劑量組 10 1.19±0.15*# 1.55±0.18*#☆△消癖煎高劑量組 10 1.11±0.14*# 1.30±0.24#

表3 各組大鼠血清中E2、P、PRL水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清中E2、P、PRL水平比較（±s）

注： 與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性藥物組比較，☆P＜0.05；與消癖煎高劑量組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 E2/（pg/mL） P/（ng/mL） PRL/（μIU/mL）空白對照組 10 33.743±11.046 29.658±7.215 34.273±3.548模型對照組 10 79.332±9.752* 14.797±5.574* 48.505±5.110*陽性藥物組 10 41.588±10.053# 26.069±8.257# 32.642±5.847#消癖煎低劑量組 10 60.883±9.189*#☆△ 19.638±7.012*△ 41.804±7.439*#☆△消癖煎中劑量組 10 45.510±11.031*#△ 24.199±10.705# 35.416±4.364#消癖煎高劑量組 10 37.649±8.911# 29.684±7.013# 33.823±5.071#

本實驗采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮制備乳腺增生大鼠模型，造模后大鼠乳頭直徑增大，高度增加，病理切片顯示有明顯的乳腺組織增生現(xiàn)象，血清E2、PRL水平升高，P水平降低，提示造模成功。乳腺直徑和高度變化是乳腺的外觀表現(xiàn)，乳腺組織病理形態(tài)學(xué)改變是乳腺的內(nèi)在改變，乳腺的外觀表現(xiàn)和內(nèi)在改變是乳腺增生疾病臨床表現(xiàn)的重要組成部分，可以了解疾病的發(fā)生發(fā)展及嚴重程度。本研究結(jié)果表明，消癖煎可以有效抑制乳腺增生模型大鼠乳頭直徑的增大和乳頭高度的增加，以高劑量組效果最為明顯，且與陽性藥物治療效果相當，病理切片進一步證實消癖煎可有效抑制乳腺組織增生，從動物實驗角度證實消癖煎對乳腺增生的治療作用。目前，國內(nèi)外大部分研究表明體內(nèi)雌、孕激素分泌紊亂是引發(fā)乳腺增生癥的直接推動力：雌、孕激素比例失調(diào)，使乳腺實質(zhì)增生過度和復(fù)舊不全；催乳素升高，影響乳腺生長、發(fā)育和泌乳功能，同時影響下丘腦—垂體—性腺軸功能[9，11]。本研究結(jié)果提示消癖煎治療乳腺增生的作用機制可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平有關(guān)。

下一步擬對乳腺組織雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）表達進行研究，從而進一步揭示消癖煎治療乳腺增生的作用機制。

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)（HE染色，×200）

表4 各組大鼠乳腺組織病理切片評級比較