人類腫瘤中Tie2陽性單核巨噬細(xì)胞研究進(jìn)展

江楚怡，蔡晶，王澤華，陳媛媛

0 引言

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages,TAMs）是一類具有高度異質(zhì)性和可塑性的細(xì)胞，有M1（抗瘤）和M2（促瘤）兩種表型。在微環(huán)境的介導(dǎo)下，腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化，通過鈍化抗腫瘤免疫、刺激血管淋巴管生成、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤進(jìn)展，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[1]。Tie2 陽性單核巨噬細(xì)胞（Tie2 expressing monocytes/macrophages,TEMs）是表達(dá)酪氨酸激酶受體Tie2（tyrosine kinase receptors with immunoglobulin and EGF homology domains receptors-2）的單核巨噬細(xì)胞，是促血管生成和組織重塑功能極強(qiáng)的TAMs亞群[2]。

Tie2是人血管生成素（angiopoietin,Ang）1、2、4的受體，主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，參與調(diào)控胚胎血管發(fā)育、傷口愈合和腫瘤血管新生等生理和病理性血管生成過程。2003年De Palma等首次發(fā)現(xiàn)表達(dá)Tie2的CD11b+骨髓來源細(xì)胞，并命名為TEMs[3]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤TEMs承擔(dān)大部分骨髓來源細(xì)胞的血管生成活性[2]，同時(shí)參與腫瘤淋巴管生成[4]和抑制腫瘤特異性免疫反應(yīng)[5]，是TAMs中發(fā)揮促瘤作用的重要細(xì)胞亞群。

本文就TEMs在腫瘤中的浸潤、功能及其機(jī)制進(jìn)行綜述，并總結(jié)其作為腫瘤標(biāo)志物的臨床價(jià)值和可能的靶向治療策略，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新的思路。

1 TEMs在腫瘤患者外周血和癌組織中比例增高

健康人的外周血中TEMs約占總外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的1.6%～7.4%，而腫瘤患者外周血中TEMs含量顯著增高[6]。Wang等分析發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者外周血中TEMs（CD14+Tie2+）占單核細(xì)胞（CD14+）的比例（n=30,5.77%±4.86%）顯著高于健康志愿者（n=25,2.25%±2.89%,P=0.0024）和良性囊腫患者（n=52,2.96%±4.85%,P=0.0124）[7]；另有研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者外周血中TEMs（CD14+CD16+Tie2+）占單核細(xì)胞（CD14+CD16+）的比例（n=82,3.77%～13.45%）高于肝硬化患者（n=29,2.36%～9.43%,P＜0.05）[8]。

腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)Ang2，使局部Ang2水平升高，從而趨化外周血TEMs向腫瘤部位遷移[6]；且TEMs表達(dá)趨化因子受體CXCR4，腫瘤部位的趨化因子CXCL12亦可介導(dǎo)TEMs的招募[9]，使腫瘤組織中浸潤的TEMs增加。乳腺癌患者腫瘤組織中約有95%的CD14+細(xì)胞表達(dá)高水平Tie2[4]；腎癌患者腫瘤組織中TEMs（CD14+Tie2+）占單核細(xì)胞（CD14+）的比例約23.15%～84.32%（中位數(shù)62.12%），而配對的遠(yuǎn)處正常組織中TEMs僅占1.51%～12.33%（中位數(shù)4.88%）[10]。

2 癌相關(guān)TEMs來源

腫瘤組織TAMs可來源于骨髓細(xì)胞和組織滯留巨噬細(xì)胞[11]，為了明確TEMs的來源，De Palma等用綠色熒光蛋白GFP特異性標(biāo)記小鼠骨髓祖細(xì)胞的Tie2，發(fā)現(xiàn)腫瘤部位有一群表達(dá)GFP的CD45+Gr1-CD11b+CD31-單核細(xì)胞，且與內(nèi)皮細(xì)胞（GFP-CD11b-CD31+）混雜在一起，表明腫瘤浸潤TEMs可來源于骨髓，且與血管生成有關(guān)[3]。而外周血中的單核細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞表面Gr1、Ccr2（單核細(xì)胞趨化因子CCL2的受體）、CD621（Sell，L-選擇素）、CX3CL1（趨化因子fractalkine的受體）和CD43（唾液蛋白）表達(dá)的不同可分為Gr1+Ccr2+CD621+CX3CL1lowCD43-炎性單核細(xì)胞（來源于骨髓）和Gr1-Ccr2-CD621-CX3CL1highCD43+滯留單核細(xì)胞兩種[12]。Pucci等發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠腫瘤浸潤TEMs與正常小鼠外周血Gr1-滯留單核細(xì)胞有相似的基因表型，如Arg1、Igf1、Cxcl12、Lyve1、Stab1、Cd163、Edg1、Mrc1表達(dá)上調(diào)，而Sell、Ccr2、Ptgs2/Cox2表達(dá)下調(diào)，提示來源于滯留單核細(xì)胞的循環(huán)TEMs可遷移至腫瘤組織[2]。

腫瘤TEMs通過以下方式實(shí)現(xiàn)Tie2表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧可顯著上調(diào)單核細(xì)胞或單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞表面Tie2的表達(dá)，使腫瘤TEMs增加[13]。此外，膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1（CTHRC1）在多種實(shí)體瘤中表達(dá)升高，可通過ERK-AP-1途徑上調(diào)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞Ang2表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤TEMs的增加[14]。

3 TEMs促進(jìn)腫瘤生長轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制

3.1 TEMs促進(jìn)腫瘤血管生成

血管生成是腫瘤進(jìn)展的主要限速步驟之一[15]，因血管內(nèi)皮細(xì)胞中Ang-Tie2軸調(diào)控血管生成的作用在多種模型中得到驗(yàn)證[16]，所以TEMs對腫瘤血管生成的作用受到廣泛關(guān)注。

Coffelt等通過體外內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽和成管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健康人外周血中的TEMs（CD14+Tie2+）已經(jīng)具有促血管生成活性，與這些TEMs與Tie2-單核細(xì)胞（TNMs）相比，MMP9、VEGFA、COX-2、WNT5A及MRC1的mRNA水平更高，且分泌更高水平的促血管生成因子MMP9和VEGFA[17]。Venneri等在體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)中得到相同的結(jié)果，將健康人外周血中的TEMs（CD14+Tie2+）和TNMs（CD14+Tie2-）分別與人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87按一定比例混合注射，使裸鼠形成皮下瘤，發(fā)現(xiàn)TEMs組從腫瘤周圍向中心延伸出豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，而TNMs組僅在腫瘤外周排列有小的內(nèi)生血管邊緣、中心區(qū)只有少量的新生血管，說明TEMs與TNMs相比更能促進(jìn)腫瘤血管生成，而且TEMs組的瘤體積比TNMs組更大，提示TEMs對腫瘤生長具有促進(jìn)作用[6]。

研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌患者腫瘤組織微血管密度（MVD）與腫瘤浸潤TEMs（CD14+Tie2+）有關(guān)，TEMs占單核細(xì)胞（CD14+）比例越高，MVD越高（P＜0.0001）[10]；卵巢癌患者腫瘤組織MVD同樣與腫瘤浸潤TEMs（CD68+Tie2+）占巨噬細(xì)胞（CD68+）的比例呈正相關(guān)[7]，從臨床病理組織層面說明腫瘤浸潤TEMs可以促進(jìn)腫瘤血管生成。

3.2 TEMs促進(jìn)腫瘤淋巴管生成

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要方式之一，淋巴管生成則是發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[18]，且越來越多的證據(jù)表明TAMs可參與腫瘤淋巴管生成[19]，TEMs亦如此。

Bron等分析乳腺癌患者的組織切片，發(fā)現(xiàn)TEMs可表達(dá)經(jīng)典的淋巴管標(biāo)志物血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR-2、VEGFR-3）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體、平足蛋白以及VEGFR共受體神經(jīng)纖毛蛋白2，且有部分TEMs嵌入到淋巴管結(jié)構(gòu)中，提示TEMs很可能參與腫瘤淋巴管生成；角膜淋巴管生成和3D纖維蛋白凝膠淋巴管生成試驗(yàn)則分別在體內(nèi)和體外證明TEMs可促進(jìn)淋巴管生成；而且同時(shí)抑制Tie2和VEGFR激酶活性時(shí)TEMs的促淋巴管生成功能被明顯抑制，提示Tie2和VEGFR協(xié)同控制腫瘤TEMs的促淋巴生成活性[4]。在宮頸癌中，循環(huán)TEMs比例與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[20]，提示腫瘤組織TEMs很可能通過促進(jìn)淋巴管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

3.3 TEMs參與免疫抑制微環(huán)境的形成

TEMs在腫瘤免疫方面的功能也受到研究者們的關(guān)注。Coffelt等將健康志愿者外周血中分離得到的TEMs和自體CD3+T細(xì)胞按1:1的比例在體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ang2預(yù)處理的TEMs（Ang2-TEMs）可抑制T細(xì)胞增殖，加入IL-10抗體則可逆轉(zhuǎn)Ang2-TEMs的抑制作用，提示Ang2-TEMs通過IL-10發(fā)揮抑制作用；分析共培養(yǎng)后CD3+T細(xì)胞的亞群情況，發(fā)現(xiàn)Ang2-TEMs組CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例下降、CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著上升，且CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞的活化狀態(tài)）比例升高，IL-10抗體同樣可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象；分選出Ang2-TEMs與CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)后的CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞再次與自體CD3+T細(xì)胞共培養(yǎng)，這些Treg細(xì)胞也能抑制T細(xì)胞增殖；這一結(jié)果在MMTV-PyMT小鼠自發(fā)乳腺癌和4T1乳腺癌皮下瘤模型中得到驗(yàn)證，但腫瘤組織中Ang2水平和TEMs（F4/80+Tie2+）表達(dá)的IL-10水平升高僅在腫瘤生長早期出現(xiàn)，提示在腫瘤環(huán)境中升高的Ang2誘導(dǎo)TEMs高表達(dá)IL-10，使CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞池?cái)U(kuò)張、抑制T細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤早期進(jìn)展[21]。

此外，Ibberson等將從侵襲性乳腺癌患者新鮮腫瘤組織中分選出的TEMs和CD11c+樹突狀細(xì)胞（DCs）分別或同時(shí)與自體外周血T細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，DCs可提呈腫瘤抗原、刺激T細(xì)胞發(fā)生腫瘤特異性反應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖，雖然TEMs與T細(xì)胞單獨(dú)共培養(yǎng)可刺激T細(xì)胞發(fā)生輕微增殖，但當(dāng)TEMs和DCs同時(shí)與T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)TEMs反而抑制DCs刺激T細(xì)胞增殖的作用[5]；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者腫瘤組織中的TEMs和DCs均表達(dá)抗原提呈細(xì)胞的標(biāo)記如HLA-DR、CD80、CD86及CD1a，且TEMs表面CD86水平（93.3±3.7）顯著高于DCs（28.4±8.5,P＜0.01），加入CD86抗體可逆轉(zhuǎn)腫瘤TEMs對DCs功能的抑制作用，說明腫瘤TEMs通過高表達(dá)CD86抑制DCs功能進(jìn)而阻礙T細(xì)胞發(fā)生腫瘤特異性反應(yīng)[5]。由此可見，腫瘤TEMs不僅可以抑制T細(xì)胞增殖，還能抑制T細(xì)胞發(fā)生腫瘤特異性反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫抑制的作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，TEMs主要依靠其促血管生成、淋巴管生成和免疫抑制等功能來發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

4 TEMs作為腫瘤生物標(biāo)志物的臨床意義

4.1 循環(huán)TEMs的臨床診斷價(jià)值

循環(huán)TEMs在腫瘤患者中顯著增高，提示其作為臨床診斷指標(biāo)的可能性。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)AFP陰性的肝細(xì)胞癌患者外周血單核細(xì)胞中TEMs的比例明顯高于乙肝肝硬化、慢性乙肝感染者和健康人，且循環(huán)TEMs區(qū)分AFP陰性肝細(xì)胞癌和乙肝肝硬化的敏感度和特異性可達(dá)到80.0%和65.52%[8]，提示TEMs可作為AFP陰性肝細(xì)胞癌的補(bǔ)充標(biāo)志物用于鑒別診斷。最新研究發(fā)現(xiàn)外周血中TEMs比例在非小細(xì)胞肺癌[22]和宮頸癌[20]中亦可作為潛在的診斷標(biāo)志物。

4.2 腫瘤組織中TEMs可作為腫瘤患者的預(yù)后標(biāo)志物

回顧性研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌患者隨腫瘤組織TEMs浸潤增多，其肝臟部分切除術(shù)后的生存率相應(yīng)下降，腫瘤TEMs浸潤豐富的患者1、3、5年生存率分別為63.3%、42.8%、42.8%，均低于TEMs浸潤缺乏的患者（79.6%、77.1%、75.0%）[23]。在腎細(xì)胞癌[10]中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，但在肝門膽管癌的回顧性研究中出現(xiàn)了不同的結(jié)果，腫瘤組織TEMs浸潤豐富的肝門膽管癌患者術(shù)后1、3、5年生存率分別為83.2%、62.2%、56.6%，均高于TEMs浸潤缺乏的患者（71.3%、36.3%、14.9%）[24]。所以腫瘤浸潤TEMs在不同腫瘤中所代表的預(yù)后和生存情況可能是不一樣的，還需具體情況具體分析。

4.3 腫瘤組織中TEMs可作為治療反應(yīng)的標(biāo)志物

在小鼠乳腺癌模型中，抗血管藥物CA4P治療后會引起腫瘤浸潤TEMs（CD31-F4/80+Tie2+）增加，啟動(dòng)血管修復(fù)進(jìn)而限制CA4P的療效[9]；而且TEMs浸潤增加與小鼠惡性膠質(zhì)瘤抗VEGF藥物貝伐單抗治療后的耐藥、復(fù)發(fā)及侵襲表型有關(guān)[25]。腫瘤組織TEMs浸潤增加還與肝細(xì)胞癌[23]、腎細(xì)胞癌[10]和非小細(xì)胞肺癌[22]等多種腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，與肝門膽管癌[24]術(shù)后復(fù)發(fā)率呈負(fù)相關(guān)，提示組織TEMs可評估多種腫瘤治療方式的治療反應(yīng)。

5 靶向TEMs的治療策略

TEMs作為TAMs的亞群，參考TAMs的治療策略[26]，目前針對TEMs預(yù)計(jì)的可行治療方向主要有以下幾點(diǎn)：（1）改造TEMs的前體細(xì)胞。改造前體細(xì)胞使其不能分化成TEMs，從源頭減少TEMs的形成。乳腺癌患者的血漿通過胎盤生長因子（PIGF）誘導(dǎo)CD34+造血祖細(xì)胞分化成具有促血管和淋巴管生成活性的Tie2+CD11b+骨髓細(xì)胞，沉默鼠源乳腺癌細(xì)胞系4T1中PIGF的表達(dá)，可使CD34+造血祖細(xì)胞向TEMs分化減少，阻礙腫瘤血管生成和血流灌注，進(jìn)而抑制腫瘤生長[27]；（2）阻斷趨化因子，防止TEMs向腫瘤部位聚集。TEMs的促血管生成活性和腫瘤招募TEMs受Ang-Tie2軸的嚴(yán)格調(diào)控[17]，故成為臨床試驗(yàn)治療的目標(biāo)。AMG386可抑制Ang1/2-Tie2相互作用，其單獨(dú)或聯(lián)合化療應(yīng)用在多種實(shí)體瘤中均有效果[28]，尤其是卵巢癌[29]；（3）重塑TEMs。腫瘤浸潤TEMs表現(xiàn)為M2型[2]，重塑TEMs使其變成M1型巨噬細(xì)胞，可抑制腫瘤血管生成、改變腫瘤免疫微環(huán)境從而推遲腫瘤生長，延長生存期[30]。負(fù)荷乳腺癌4T1或黑色素瘤B16的C57BL/6小鼠經(jīng)紫杉醇處理后M1型巨噬細(xì)胞比例顯著上升，且有抑制腫瘤進(jìn)展的作用[31]；（4）靶向TEMs的效應(yīng)分子。TEMs發(fā)揮不同功能所依賴的效應(yīng)因子是不同的，所以可靶向的目標(biāo)是多樣的。卵巢癌TEMs經(jīng)Ang2趨化誘導(dǎo)后可旁分泌IGF1，使腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞IGF1R磷酸化增加以促進(jìn)血管生成，動(dòng)物試驗(yàn)證明應(yīng)用IGF1抗體可以逆轉(zhuǎn)這種促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，進(jìn)而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，所以Ang2-TEMs-IGF1很可能成為潛在的治療靶點(diǎn)[7]；（5）耗竭TEMs。通過藥物、免疫毒素偶聯(lián)抗體靶向TEMs，進(jìn)而導(dǎo)致TEMs的耗竭也是不錯(cuò)的思路。臨床Ⅲ期試驗(yàn)表明CSF-1R抑制劑PLX3397的使用可使巨噬細(xì)胞耗竭，從而抑制腱鞘巨細(xì)胞瘤的進(jìn)展，并顯著改善患者生活質(zhì)量[32]；但這種治療方式的靶向毒性即腫瘤外巨噬細(xì)胞的清除以及長期使用后的耐藥性是仍需面對的挑戰(zhàn)，見表1。

6 小結(jié)

TEMs在腫瘤患者外周血和癌組織中占單核巨噬細(xì)胞的比例顯著增加，通過促進(jìn)血管和淋巴管生長、抑制腫瘤免疫從而驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。初步證據(jù)顯示，循環(huán)TEMs可作為新型標(biāo)志物用于腫瘤早期診斷和預(yù)后預(yù)測，一些靶向TEMs的治療方案正在臨床前和臨床研究階段。循環(huán)和組織浸潤TEMs作為腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。

表1 靶向TEMs的治療策略Table1 Treatment strategies for targeting TEMs