膀胱癌靶向分子載體的研究進展

閆鵬宇，閆旭韜，楊勇軍綜述，楊曉峰審校

0 引言

膀胱癌（bladder cancer,BC）是中國泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，約75%新診斷的BC為非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC），局限于膀胱壁黏膜或黏膜下層，主要治療手段為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術（transurethral resection of the bladder tumor,TURBT）聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注化療藥物。但TURBT術后1年腫瘤復發(fā)率為40%～80%，25%的患者進展為肌層浸潤性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer,MIBC）[2]。目前普通白光膀胱鏡檢查是BC診斷和術后隨訪的標準技術手段，其對微小腫瘤、原位癌、術中殘留腫瘤的識別能力有限，導致腫瘤的漏診，而常規(guī)膀胱內(nèi)灌注藥物的不良反應嚴重影響患者術后生活質(zhì)量[3]。因此，如何精準地發(fā)現(xiàn)病灶及界定腫瘤的邊界、既能徹底切除腫瘤又能減少正常組織細胞的損傷成為了BC臨床診療亟需解決的問題。

隨著B C 靶向分子載體、靶向特異性作用機制、靶向光學分子影像和靶向光免疫療法（photoimmunotherapy,PIT）研究的不斷深入，BC的靶向診療有望取得新的進展。為此，本文結合國內(nèi)外最新文獻及本研究組的前期工作，將已發(fā)現(xiàn)的BC靶向分子載體的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 靶向基團的種類及特性

靶向分子載體是指能夠特異識別抗原蛋白并與之緊密結合的靶向基團，主要包括抗體、抗體片段、支架蛋白、肽和小分子等，見表1[4]?？贵w與抗原特異性結合以及成熟的抗體制備技術，使其成為臨床應用最多的一類靶向基團，但單克隆抗體分子量較大（約150 kDa）、腎臟不能排泄、體內(nèi)主要通過肝臟分解代謝，導致抗體具有血液內(nèi)循環(huán)時間長、非特異性組織蓄積和組織穿透能力差等缺點[5-6]。而采用化學技術制備的抗體片段（微抗體、抗原結合片段、雙抗體、單鏈可變片段等），分子量約為15～80 kDa，既保留了完整抗體特異性結合抗原的生物學特性，又具有組織滲透性強和血液滯留時間短的優(yōu)點[7]。

另外，最新關注的靶向基團還有非免疫球蛋白類支架蛋白（scaffolds protein），如親和體、結蛋白和Centyrin等[8-10]，這些蛋白支架既有類似抗體的靶向功能，又具有相對分子量小、高親和力、折疊速率快、理化性能穩(wěn)定、能接受化學修飾等優(yōu)點。

此外，肽類和小分子的分子量最小，能與腫瘤特異性結合，而不與或很少與正常組織、細胞結合的小分子肽被稱為腫瘤導向肽（tumor homing peptide,THP）。THP為基礎的載體系統(tǒng)能夠有效穿透組織且?guī)缀鯚o免疫原性，其半衰期短、腎清除率快、組織蓄積少以及生產(chǎn)工藝便捷、成本更低等優(yōu)勢[11]，具有良好的應用前景。

2 膀胱癌靶向分子載體

2.1 抗體及其衍生物

CD47是一種普遍存在于人類細胞膜表面的跨膜糖蛋白，與巨噬細胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α結合后能抑制其吞噬功能使腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸[12]。CD47在80%以上的BC細胞膜上高表達，包括乳頭狀尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、微乳頭狀瘤及腺癌[13]。本項目組使用Alexa Fluor 790標記的抗-CD47孵育26例新鮮離體人BC組織進行近紅外熒光成像，腫瘤組織的平均熒光強度明顯高于臨近正常組織（分別為132.31±6.67和52.27±12.09,P＜0.001），見圖1[14]。Pan等[13]評價了抗-CD47-Qdot625介導的內(nèi)鏡分子成像檢測BC的診斷準確性，21例新鮮完整膀胱標本經(jīng)抗-CD47-Qdot625孵育后，在藍光下檢測到119個可疑區(qū)域，通過病理學驗證，其診斷敏感度和特異性分別為82.9%和90.5%。

CAⅨ是碳酸酐酶家族中的一員，在缺氧條件下調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值，進而改變腫瘤細胞的黏附、增殖和進展的生物學特性[15]。免疫組織化學染色顯示CAⅨ在BC組織中的陽性率高達67.1%，在正常的尿路上皮和膀胱慢性炎性病變組織中均呈陰性（P＜0.01）[16]。Wang等[17]在8例新鮮完整膀胱標本內(nèi)灌注抗-CAⅨ-Qdot625，白光膀胱鏡診斷BC的敏感度為76.0%，特異性為90.5%，而抗-CAⅨ介導的藍光內(nèi)鏡分子成像下的腫瘤檢測獲得了較高的診斷準確率，總體敏感度和特異性分別為88.00%和93.75%。

PIT是一種新型的分子靶向光動力治療模式，親水性酞菁染料IR700與單克隆抗體結合進行的靶向性PIT，有效減少了單純IR700光動力療法的不良反應[18]。Kiss等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗-CD47-IR700介導的PIT治療，IR700使用劑量低，但顯著增加了人膀胱腫瘤細胞系和原代膀胱腫瘤細胞的細胞毒作用。通過尾靜脈注射抗-CD47-IR700對BC異種移植小鼠模型進行近紅外光免疫治療（NIRPIT），單次治療發(fā)現(xiàn)NIR-PIT組腫瘤生長明顯減慢，在連續(xù)5周的治療后，NIR-PIT能夠有效抑制腫瘤生長（P=0.0104），明顯延長治療組小鼠的生存期（P=0.009）[20]。

表1 靶向基團的種類及特征[4]Table 1 Types and characteristics of targeting groups[4]

圖1 膀胱癌組織圖像Figure 1 Images of bladder cancer tissues

單鏈可變片段（single-chain variable fragment,scFv）是抗體內(nèi)部結合抗原的最小功能結構域，Rezaei等[20]開發(fā)了新型抗-CD47-scFv磁性納米粒子（magnetic nanoparticles,MNP），體外研究表明抗-CD47-scFv-MNP對BC細胞系EJ138和5637具有高親和力，經(jīng)外磁場作用的靶向熱療后能顯著降低腫瘤細胞存活率。

2.2 腫瘤導向肽（THP）

目前，利用噬菌體展示肽庫技術和組合化學方法，先后篩選出四種與BC結合的靶向配體，分別是九肽序列Bld-1[21]、環(huán)九肽序列PLZ4[22]、環(huán)七肽序列NYZL1[23]和PLSWT7[24]。其中前兩種篩選自MIBC細胞系，后兩種則來自NMIBC細胞系。研究顯示，四種THP均能在離體細胞、組織和小鼠體內(nèi)與BC特異性結合，但它們結合腫瘤細胞的分子位點目前還不清楚[21-24]。

PLSWT7是目前唯一運用于內(nèi)鏡下分子成像的多肽載體。Peng等[24]將PLSWT7-IRDye800CW分子探針灌注入8例離體人膀胱腔內(nèi)，分析了40個膀胱內(nèi)感興趣區(qū)域，進行了近紅外分子成像診斷與組織病理學比較研究，發(fā)現(xiàn)PLSWT7-IRDye800CW分子影像診斷BC的敏感度和特異性分別為84.00%和86.70%。

常規(guī)尿液脫落細胞檢查是一種簡單易行的非侵入性診斷方法，但檢測的敏感度較低。Jia等[25]使用Bld-1-FITC探針結合80例血尿患者尿液中的腫瘤細胞，其診斷BC的敏感度和特異性分別為79.31%和100%，優(yōu)于尿脫落細胞學檢查和熒光原位雜交技術檢查（敏感度分別為20.69%和72.41%）。另外一項包含66例BC的研究發(fā)現(xiàn)，NYZL1-FITC探針與尿液中腫瘤細胞的結合與腫瘤惡性程度成正比，平均陽性結合百分比在Ta、T1、T2和T3～T4期分別為30%、57%、73%和85%[26]。

在靶向化療方面，Bld-1能夠與凋亡肽KLA和阿霉素（DOX）構建靶向制劑，并內(nèi)化進入人膀胱癌HT1376細胞[27-28]。Jung等[27]評價了Bld-1-KLA在小鼠體內(nèi)的治療效能，靜脈注射給藥4周后，Bld-1-KLA組小鼠的腫瘤體積明顯小于對照組（P＜0.001）。Wei等[28]使用Bld-1-DOX治療荷瘤小鼠16天后，Bld-1-DOX組的腫瘤體積明顯縮小，且小鼠無明顯不良反應，而單用DOX治療組出現(xiàn)明顯的心臟和肝臟損害。Lin等[29]開發(fā)了PLZ4靶向納米膠束，在靶向遞送方面的效率是非靶向膠束的1.5倍（P＜0.05）且是游離染料的14.3倍（P＜0.01），靶向膠束不僅能黏附在腫瘤細胞表面，還能被靶細胞攝取。使用PLZ4納米膠束介導的紫杉醇（PTX）進行靶向化療，成功將荷瘤小鼠的中位存活期從單純紫杉醇治療組的55天提高到了靶向治療組的69.5天（P=0.03）[30]。

術中光學分子影像引導的外科手術被認為是繼開放手術、微創(chuàng)外科手術之后的第三代外科手術新模式。傳統(tǒng)的依據(jù)白光內(nèi)窺鏡圖像和操作者的經(jīng)驗確定腫瘤浸潤深度和手術切緣的方式具有主觀性。一項涉及8490例經(jīng)TURBT治療BC患者的系統(tǒng)回顧顯示，17%～67%的初發(fā)Ta期患者和20%～71%的初發(fā)T1期患者在復發(fā)時發(fā)現(xiàn)了殘留腫瘤，36%～86%殘留腫瘤位于初次切除部位[3]。Peng[24]等采用PLSWT7-IRDye800CW進行了分子成像引導BC手術治療的臨床前研究，將小鼠異種移植模型隨機分為兩組：對照組（n=20）和實驗組（n=20）分別在自然光和光學分子成像下進行腫瘤切除術。1周后，對照組和實驗組腫瘤復發(fā)率分別為95%和5%；術后30天兩組的總存活率分別為0和90%。

3 膀胱癌的多載體靶向和多模態(tài)診療

BC具有較強的異質(zhì)性，單純的一種靶向分子載體很難使全部患者受益，使用抗-CD47、抗-CAⅨ和無靶向性IgG4三種單抗對離體BC組織進行多路復合分子成像發(fā)現(xiàn)，診斷圖像較單靶點成像噪聲更低，分辨率更加精準（ROC AUC為0.93（0.73,1.0））[31]。多模態(tài)分子探針能集成多種成像和（或）治療模式，Lin等[32]開發(fā)的PLZ4-納米卟啉平臺，在進行BC光動力學診斷的同時實現(xiàn)BC的靶向光動力學治療、靶向光熱治療和靶向化療結合的三模態(tài)治療，顯著提升BC的臨床診斷水平和治療水平。

4 展望與挑戰(zhàn)

綜上所述，靶向分子載體介導的靶向性定位功能在膀胱癌早期診斷、完整切除、靶向治療等方面具有巨大的應用潛力，但仍有許多科學問題和技術難點需要解決，比如靶向載體、連接體、熒光染料等的安全性驗證，臨床有效性的標準化評價體系的建立等，需要臨床醫(yī)生、化學家、物理學家、藥理學家和工程師之間的多學科交叉協(xié)作。