黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族及光調(diào)控表達(dá)模式分析＊

王星文，吳 端，師玉華，張 棟，丁丹丹，馬婷玉，向 麗＊＊

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100700；2. 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部北京 100083；3. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心 貴陽 550025）

中藥青蒿源于菊科植物黃花蒿（Artemisia annua）的干燥地上部分，味苦、辛，性寒；歸肝、膽經(jīng)，具有清虛熱，除骨蒸，解暑熱，截瘧，退黃等功效，在中國(guó)具有2000 多年的藥用歷史[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿主要藥用有效成分為倍半萜類物質(zhì)，其中青蒿素以極高的抗瘧活性著名，青蒿素聯(lián)合療法（Artemisinin-based combination therapies，ACTs）是目前為止治療瘧疾，尤其是腦瘧和對(duì)氯喹耐藥的瘧疾，最高效快速且無嚴(yán)重副作用的治療手段，此外青蒿素類藥物還具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]。青蒿素在野生黃花蒿植物體內(nèi)含量較低，目前對(duì)青蒿素高產(chǎn)的黃花蒿優(yōu)質(zhì)株系培育已有大量研究[3]，但其生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制卻還未完全明晰。因此，深入研究青蒿素合成途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)培育高含量植株，促進(jìn)青蒿素生物合成及開發(fā)青蒿素類藥物等具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是影響藥用植物次生代謝物質(zhì)合成和積累的重要調(diào)控因子，其中堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中分布最廣泛、最保守的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在擬南芥[4]、黃瓜[5]、苦蕎[6]、油菜[7]、水稻[8]等植物中均有報(bào)道，主要參與抵御生物脅迫與非生物脅迫[9,10]、調(diào)控種子休眠萌發(fā)[11,12]、光信號(hào)傳導(dǎo)[13]及組織生長(zhǎng)分化[14]等植物生理過程。

研究已證明，植物激素對(duì)青蒿素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有積極作用[15]，bZIP轉(zhuǎn)錄因子主要通過參與脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑來影響青蒿素的合成，如AabZIP1 通過結(jié)合ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)元件ABRE，激活青蒿素合成途徑上關(guān)鍵酶紫杉醇二烯合酶（Amorpha-4,11-diene synthase，ADS）和細(xì)胞色素P450 單加氧酶（CYP71AV1）基因的啟動(dòng)子表達(dá)[16-18]，bZIP同時(shí)也部分參與到水楊酸（Salicylic acid，SA）與茉莉酸（Jasmonic acid，JA）對(duì)青蒿素合成的調(diào)控中[19,20]。雖然一些研究表明這與bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族特異性識(shí)別A-box（TACGTA），C-box（GACGTC）和Gbox（CACGTG）等核心基序?yàn)椤癆CGT”的順式作用元件密切相關(guān)，但具體的分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索[21-22]。

光作為必要能量和重要的環(huán)境信號(hào)因子，在藥用植物次生代謝物質(zhì)合成和積累中起重要調(diào)控作用，Hong 等[23]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光下過表達(dá)擬南芥隱花色素1（Cryptochrome Circadian Regulator 1，CRY1）基因的黃花蒿植株，青蒿素含量明顯增加；Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)紅光和白光脅迫對(duì)青蒿素代謝途徑中關(guān)鍵酶基因具有激活作用；此外，UV-B、UV-C 也對(duì)青蒿素的合成具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用[25]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族作為重要的光信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控因子，其H 亞族成員HY5 轉(zhuǎn)錄因子（Long hypocotyl 5）可以通過結(jié)合G-box 激活下游許多光誘導(dǎo)基因的表達(dá)，如青蒿中的β-pine 烯合酶基因（QH6）及青蒿素正向調(diào)節(jié)因子AaGSW1，對(duì)青蒿素底物法呢基焦磷酸酯（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的合成也具有一定影響[13,26,27]。

隨著Shen 等[28]對(duì)黃花蒿核基因組數(shù)據(jù)測(cè)序的完成，黃花蒿bZIP（AabZIP）基因家族的全面分析及基因功能研究已成為可能。本研究基于黃花蒿基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)手段，通過對(duì)黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)及不同光照條件下基因表達(dá)情況等進(jìn)行研究，以期為后續(xù)深入探索黃花蒿bZIP基因功能，解析青蒿素合成途徑及光信號(hào)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制，黃花蒿良種選育等工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃花蒿bZIP家族鑒定和序列檢索

本研究以黃花蒿（Artemisia annua）基因組數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)：PRJNA416223）為研究對(duì)象，對(duì)應(yīng)基因組數(shù)據(jù)獲取自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genomes/?txid= 35608），對(duì)應(yīng)的擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列獲取自TAIR 數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）。通過構(gòu)建本地黃花蒿全基因組序列數(shù)據(jù)庫，利用Wang 等[29]報(bào)道的71 條擬南芥（Arabidopsis thaliana）bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列執(zhí)行本地BLAST 搜索（E-value =1e- 10）；同時(shí)利用Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）下載的bZIP轉(zhuǎn)錄因子隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）矩 陣 文 件bZIP_1（PF00170）、bZIP_2（PF07716）、bZIP_C（PF12498）、bZIP_Maf（PF03131）對(duì)黃花蒿基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選鑒定，合并2次鑒定結(jié)果，去除重復(fù)序列并將所得候選AabZIP蛋白序列提交Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.sanger.ac.uk/search）進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以明確黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員。此外利用在線工具ExPASy（http://expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)AabZIP蛋白質(zhì)分子量、理論等電點(diǎn)、總平均親水性等蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過在線 軟 件Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對(duì)AabZIP蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位及分析。

1.2 多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

利用MEGA7.0 軟件的MUSCLE 工具進(jìn)行多重序列聯(lián)配比對(duì)分析，利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建擬南芥-黃花蒿bZIP基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用Pairwise Deletion 處理缺失數(shù)據(jù)，P-distance 模型，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000 次。利用在線軟件 EvolView （https://www. evolgenius. info/evolview/#login）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行可視化修飾。

1.3 進(jìn)化壓力分析

利用BLAST 軟件對(duì)黃花蒿bZIP 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，利用軟件TBtools 中KaKs_Calculator 工具計(jì)算基因同義替換率（Ks）與非同義替換率（Ka），獲得基因Ka/Ks 比率。當(dāng)Ka/Ks 大于1 時(shí)認(rèn)為基因存在正向選擇效應(yīng)，當(dāng)Ka/Ks 小于1 時(shí)則認(rèn)為存在純化選擇響應(yīng)。通過計(jì)算Ka/Ks之間的比率判斷是否有選擇壓力作用于黃花蒿bZIP基因家族。

1.4 基因結(jié)構(gòu)及保守motif分析

利用在線工具meme（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)黃花蒿bZIP家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用在線工具Gene Structure Display Sever（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制AabZIP基因結(jié)構(gòu)圖并進(jìn)行可視化分析。

1.5 光調(diào)控下基因表達(dá)分析

黃花蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載于NCBI 數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)：SRP133983），利用perl 腳本解析不同光照處理下黃花蒿基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，獲?。↙ED）藍(lán)光（470 nm）、紅光（670 nm）、遠(yuǎn)紅光（735 nm）、白光及黑暗處理下黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子FPKM 值（Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads），利用TBtools 軟件對(duì)其進(jìn)行聚類及可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿bZIP基因家族的篩選與鑒定

表1 黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族信息

全基因組水平中初步篩選得到的144 條AabZIP候選蛋白序列，后經(jīng)Pfam 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，去除假陽性及結(jié)構(gòu)域極不完整的序列后（表1），最終得到78 條黃花蒿bZIP 蛋白序列作為后續(xù)分析對(duì)象。氨基酸理化性質(zhì)分析表明，78 條AabZIP 蛋白氨基酸長(zhǎng)度范圍為119 aa（AabZIP61）-649 aa（AabZIP8），對(duì)應(yīng)的分子量大小范圍為13.459（AabZIP61）-72.525（AabZIP78）KDa，其中S 亞族氨基酸長(zhǎng)度大部分小于200 aa；理論等電點(diǎn)變化范圍在10.27（AabZIP5）-4.86（AabZIP17）之間，A 亞族與H 亞族理論等電點(diǎn)多為8-10，顯堿性，而G與I亞族多為5-7，偏酸性，F(xiàn)亞家族成員及AabZIP4、AabZIP66蛋白較為穩(wěn)定。所有蛋白亞細(xì)胞定位分布于細(xì)胞核上且均表現(xiàn)為親水性（GRAVY＜0），這與Zhang 等[18]、Shen 等[22]及Zhong 等[30]的報(bào)道結(jié)果相一致。

續(xù)表

2.2 進(jìn)化壓力分析

對(duì)黃花蒿bZIP家族成員進(jìn)化選擇壓力進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，14 組同源基因序列中AabZIP21與AabZIP25存在非同義替換而無同義替換（表2）。而AabZIP75與AabZIP55僅存在同義替換，除AabZIP33/AabZIP38的KA/KS 值為0.915，AabZIP72/AabZIP58為0.610 外，其余11組序列Ka/Ks值均小于0.5，這表明大部分黃花蒿bZIP基因經(jīng)歷了強(qiáng)烈的純化選擇[29]。

表2 黃花蒿bZIP基因進(jìn)化壓力分析

2.3 基因進(jìn)化分析

為研究黃花蒿bZIP基因的進(jìn)化關(guān)系，在多序列聯(lián)配的基礎(chǔ)上，利用MAGA7.0軟件構(gòu)建黃花蒿與擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。兩者bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員在進(jìn)化上高度保守。依據(jù)Jakoby 等[4]對(duì)擬南芥的分類方法將黃花蒿bZIP基因家族分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、S 等10 個(gè)亞家族，并根據(jù)分組情況依次進(jìn)行重命名（AabZIP1-AabZIP78），同亞家族成員功能推測(cè)存在相似性。

10 個(gè)亞家族中，S 亞族的AabZIP成員數(shù)量最多，有22 條（28.2%）；B 與D 亞族數(shù)量最少，均只有1 條。研究表明D 亞族成員在植物防御病害和生理生長(zhǎng)環(huán)節(jié)中扮演著重要角色，可以與NPR1相互作用，或結(jié)合SA 誘導(dǎo)元件激活SA 介導(dǎo)的植物病原體防御機(jī)制[10]，相比擬南芥中10 條[4]，毛竹中16 條[31]，黃花蒿bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子可能在抵抗病原體侵染方面參與較少。G亞族與H 亞族成員數(shù)量分別為12 和2 條，其均可以特異性結(jié)合光誘導(dǎo)基因重要順式元件G-box[13,32]，在光形態(tài)發(fā)生和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。這也表明這2個(gè)亞族成員很可能參與到光調(diào)控下青蒿素合成途徑之中，其生物學(xué)功能具有進(jìn)一步研究意義。此外AabZIP78未與其他任何序列聚類，推測(cè)可能是其基因結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中出現(xiàn)了較大的差異，或與擬南芥中bZIP家族序列出現(xiàn)不同的進(jìn)化方向，具體的基因結(jié)構(gòu)及功能需要繼續(xù)深入探索。

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步分析黃花蒿bZIP基因之間的進(jìn)化關(guān)系，利用在線工具GSDS 構(gòu)建黃花蒿bZIP基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖（圖2），結(jié)果顯示，AabZIP亞家族與外顯子關(guān)聯(lián)明顯，同一亞家族成員基因結(jié)構(gòu)（外顯子的數(shù)量、長(zhǎng)度和位置）大多相似，而不同亞家族間表現(xiàn)出高度特異性。黃花蒿78個(gè)AabZIP基因外顯子數(shù)在1-18（AabZIP20）間分布，其中16 個(gè)（20.5%）AabZIP基因無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)且大部分集中在S 亞族。除AabZIP70外（含9 個(gè)），S 與F 亞族AabZIP序列外顯子數(shù)均為1-2個(gè)；A 與I 亞族外顯子數(shù)大多為4 個(gè)，而G 亞族AabZIP結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，其外顯子數(shù)在10-16 之間（大多為12個(gè)）；C 亞族中AabZIP17的外顯子數(shù)量（11 個(gè)）幾乎是AabZIP15（6 個(gè)）、AabZIP16（5 個(gè)）的2 倍；E 亞族的2 條基因AabZIP19（4 個(gè)）、AabZIP20（18 個(gè)）間差異也較大。保守的基因結(jié)構(gòu)變化很有可能是進(jìn)化中關(guān)鍵事件的記錄，而這些外顯子-內(nèi)含子位置與數(shù)量的差異或許會(huì)導(dǎo)致特殊的基因功能及進(jìn)化方向[33]。

2.5 蛋白保守結(jié)構(gòu)域及保守基序分析

利用Pfam 數(shù)據(jù)庫及在線軟件meme 對(duì)黃花蒿78個(gè)AabZIP蛋白保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖3）。同亞家族的AabZIP蛋白含有的保守結(jié)構(gòu)類別及位置相似，不同亞家族間差異較大。各亞家族的保守基序均與擬南芥中報(bào)道相似，說明在功能方面擬南芥bZIP序列具有很大參考作用。

AabZIP蛋白主要含有bZIP1、bZIP2和bZIPC這3種bZIP結(jié)構(gòu)域，其中大部分為bZIP1結(jié)構(gòu)域，少部分為bZIP2結(jié)構(gòu)域，且主要集中在F 亞族，bZIPC結(jié)構(gòu)域僅有一條，為C 亞族成員。除AabZIP62外，黃花蒿中bZIP家族成員均搜索到motif1（圖3b），該基序在多種植物[5-7]中均有報(bào)道，推測(cè)為黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子的保守基序。而與其他物種bZIP保守基序相比，AabZIP62存在擬南芥bZIP保守基序（N-X7-R/K-X9-L-X6-LX6-L），其功能是否具有特異性有待進(jìn)一步深入研究。AabZIP78的保守基序中-10 位由R/K 變?yōu)镮，其結(jié)構(gòu)變化與茄科植物番茄中報(bào)道的bZIP結(jié)構(gòu)域變化相吻合，推測(cè)二者親緣關(guān)系較近[34]，這與Shen 等[28]進(jìn)化分析結(jié)果一致，同樣的變化在擬南芥、水稻、葡萄、蓖麻、玉米等植物[4,8,29,35-37]中均有發(fā)現(xiàn)。I 亞族成員在-10 位均存在K 而無R，與擬南芥中報(bào)道吻合，可能與其影響維管束發(fā)育的功能有關(guān)[4]，同時(shí)也有研究表明I亞族參與植物組織分化過程[14]，Gibalová 等[38,39]等的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥 中E 亞 族AtbZIP34、AtbZIP61可 以 與I 亞 族AtbZIP18、AtbZIP52一同參與調(diào)控花粉的發(fā)育過程。

圖1 擬南芥與黃花蒿bZIP轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹

除bZIP保守基序外，AabZIP蛋白還含有其他保守的功能基序。其中，除AabZIP29外，G 亞家族成員均含有多功能鑲嵌區(qū)MFMR，其可以識(shí)別并結(jié)合順式作用元件G-box，在光調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與種子成熟中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)G 亞族成員與A 亞族AabZIP3、AabZIP9及I 亞族的AabZIP42、AabZIP52序列N 端均還發(fā)現(xiàn)了富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)在G 亞族GBF 類轉(zhuǎn)錄因子中推測(cè)具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用[32]。AabZIP29含有結(jié)構(gòu)域Mito_carr，為線粒體載體蛋白標(biāo)志。D 亞家族AabZIP18中存在DOG1 結(jié)構(gòu)域，其在擬南芥中具有控制種子休眠相關(guān)的功能[40]。A 亞族AabZIP8含有Retrotran_gag_2（逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子病毒gag蛋白）結(jié)構(gòu)域，推測(cè)可能與其特殊調(diào)控功能有關(guān)。同時(shí)，通過對(duì)AabZIP蛋白保守基序的研究還發(fā)現(xiàn)其存在Ca2+依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（R/KxxS/T）及酪蛋白激酶Ⅱ（Casein kinase II，CKII）磷酸化位點(diǎn)（S/TxxD/E），后者與光信號(hào)傳導(dǎo)緊密相關(guān)，表現(xiàn)為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而提高CKII活性很可能會(huì)使GBF轉(zhuǎn)錄因子功能增強(qiáng)，HY5轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平降低[32,41]。而在F亞族的AabZIP22、AabZIP23、AabZIP24、AabZIP26、AabZIP27序列中發(fā)現(xiàn)的萜類合酶含有的典型保守結(jié)構(gòu)（DDxxD），其功能可能是通過結(jié)合金屬離子對(duì)底物催化過程產(chǎn)生影響[42]。

圖2 AabZIP基因結(jié)構(gòu)圖

圖3 黃花蒿bZIP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 光調(diào)控下AabZIP基因表達(dá)特征分析

2.6 光調(diào)控下基因表達(dá)分析

通過解析黃花蒿在光調(diào)控下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取藍(lán)光、黑暗、紅光、遠(yuǎn)紅光、白光處理下AabZIP基因表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行聚類分析（圖4），其中，71 條AabZIP序列注釋到基因表達(dá)數(shù)據(jù)，而除AabZIP24外，AabZIP6（AabZIP7） ，AabZIP30、AabZIP32 （AabZIP31），AabZIP36 （AabZIP35） ，AabZIP47 （AabZIP48） ，AabZIP53（AabZIP54）序列均具有相同的轉(zhuǎn)錄本信息，因此無注釋內(nèi)容，AabZIP24缺失可能與基因組數(shù)據(jù)拼裝有關(guān)。

此外，除AabZIP72、AabZIP26、AabZIP58基因外，其他AabZIP基因均響應(yīng)光照脅迫，同一基因?qū)Σ煌庹彰{迫響應(yīng)水平存在較大差異。其中A 亞族、S 亞族與I亞族中的大部分基因及C亞族中的AabZIP16基因與未分組的AabZIP78基因，在藍(lán)光和紅光脅迫下高表達(dá)，S 亞族中的AabZIP70、AabZIP73基因在白光下高表達(dá)，AabZIP57、AabZIP71基因與A 亞族AabZIP12、AabZIP15基因相比黑暗在白光、藍(lán)光與紅光下的表達(dá)量均有明顯提升。E 亞族成員在遠(yuǎn)紅光中高表達(dá)。G亞 族 中AabZIP28、AabZIP29、AabZIP33、AabZIP38、AabZIP35基因在藍(lán)光下高表達(dá)，但剩下的AabZIP31、AabZIP34、AabZIP39 與AabZIP37基 因，包 括D 亞 族AabZIP18與S 亞族中的AabZIP63、AabZIP67基因，在三種中低表達(dá)，并在遠(yuǎn)紅外中有較高表達(dá)。H 亞族AabZIP40在除黑暗外的其他光脅迫中均有較高表達(dá)，但同AabZIP41基因一樣對(duì)藍(lán)光的響應(yīng)最為顯著，F(xiàn) 亞族的AabZIP22、AabZIP27基因也在藍(lán)光下高表達(dá)。I亞族表達(dá)模式不明，其成員分別對(duì)不同光脅迫處理均有較高表達(dá)。

3 討論

隨著對(duì)中藥有效成分研究的不斷深入，越來越多具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，包括萜類、黃酮類、生物堿類等等，這些次生代謝產(chǎn)物在植物中大部分都含量極低且存在化學(xué)合成困難，生物合成途徑復(fù)雜的問題，而通過轉(zhuǎn)錄因子間接調(diào)控其合成途徑中一系列關(guān)鍵酶基因的表達(dá)是現(xiàn)在較常用的一種解決方法[43]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成，但在中藥植物中報(bào)道較少。除黃花蒿中發(fā)現(xiàn)的4 個(gè)[18,19,22,30]青蒿素正向調(diào)控因子外，丹參中SmbZIP7和SmbZIP20也被發(fā)現(xiàn)可能對(duì)丹參酮的生物合成具有調(diào)控功能[44]，Sibéril? 等[45]報(bào)道長(zhǎng)春花bZIP家族GBF 轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合萜類吲哚生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因，丁硫醇合酶啟動(dòng)子上G-box 元件來抑制其表達(dá)，D 亞族TGA 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)阻礙單萜類吲哚生物堿合成的C2H2 型鋅指蛋白也很可能具有激活作用[46]。

黃花蒿屬菊科植物，基因組較大且存在大量重復(fù)序列，目前還不能將轉(zhuǎn)錄因子準(zhǔn)確定位到黃花蒿基因組上。這種高雜合性同樣也影響了黃花蒿品種選育，使品系的不穩(wěn)定性增高[3]。本文基于Shen 等[28]黃花蒿全基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)黃花蒿bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行全面分析，共鑒定出78 條AabZIP家族成員，并將其分為10 個(gè)亞族和1 個(gè)未分組成員（AabZIP78）。蛋白理化性質(zhì)分析表明AabZIP 氨基酸長(zhǎng)度、理論等電點(diǎn)、分子量大小間差異較大，但所有序列均為親水蛋白，且亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。基因進(jìn)化方面較為穩(wěn)定，除了AabZIP23與AabZIP27基因?qū)ν?，黃花蒿中的復(fù)制基因均經(jīng)歷了純化選擇壓力。結(jié)構(gòu)方面相對(duì)保守，同一亞家族成員具有高度特異性，但特殊序列如AabZIP70、AabZIP45、AabZIP19/AabZIP20等在基因結(jié)構(gòu)方面存在較大差異，AabZIP78 蛋白的bZIP 保守基序也與其他AabZIP 明顯不同，更接近番茄[34]中 報(bào) 道 的N-X9-R/KR/K-X6-L-X6-L-X6-L 結(jié)構(gòu)，這些差異都預(yù)示著該轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)新的特異性結(jié)合或進(jìn)化的可能，需要進(jìn)一步挖掘。

青蒿素的生物合成途徑由甲羥戊酸（Mevalonic acid，MVA）途徑與2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸（2-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑共同生成FPP，后經(jīng)過關(guān)鍵酶ADS，CYP71AV1，DBR2 和ALDH1等調(diào)控與非酶反應(yīng)最終完成[3]。Zhang 等[24]的研究表明，光照處理，尤其是白光可以增加FPP 的合成，而單色光中，排除可能會(huì)給植物造成較大損害的UV，除遠(yuǎn)紅光起抑制作用外，紅光、白光和藍(lán)光均可導(dǎo)致ADS與CYP71AV1基因過表達(dá)，因此推測(cè)藍(lán)光、紅光與白光是正向調(diào)控青蒿素合成的重要光質(zhì)，并且藍(lán)光對(duì)ALDH1和DBR2基因也具有誘導(dǎo)作用，同時(shí)還可以抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑中合成酶的表達(dá)，因此探究這3種光質(zhì)，尤其是藍(lán)光調(diào)控下黃花蒿基因表達(dá)模式對(duì)于促進(jìn)青蒿素合成具有重要意義。

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合光或植物激素誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子區(qū)“ACGT”元件來激活相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而參與青蒿素的合成過程。其中A 亞族可以通過與ABRE 元件（ACGTG）相互作用繼而誘導(dǎo)下游相關(guān)基因的表達(dá)，是ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的響應(yīng)因子，在植物非生物脅迫信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[9]，其參與青蒿素的合成，除AabZIP1可以激活A(yù)DS與CYP71AV1外[18]，AaABF3（與A 亞族AabZIP11有2 個(gè)氨基酸差異）也可以通過激活醛脫氫酶（ALDH1）進(jìn)而起到積極作用[30,47]。這與A 亞族主要響應(yīng)紅光與藍(lán)光脅迫相吻合。C亞族參與植物蛋白儲(chǔ)存過程并響應(yīng)光調(diào)控[12,48]，Shen 等[22]對(duì)AabZIP9（與C 亞族AabZIP16有3個(gè)氨基酸差異）的研究發(fā)現(xiàn)其可以激活A(yù)DS基因，而AabZIP16在藍(lán)光下高表達(dá)，因此推測(cè)其功能應(yīng)與AabZIP9一致。

H 亞族與G 亞族均可能通過結(jié)合G-box 參與調(diào)控。其中G 亞族部分基因表現(xiàn)為對(duì)藍(lán)光的高響應(yīng)，剩余G 亞族，包括D 亞族AabZIP18、E 亞族AabZIP19、AabZIP20及部分S 亞族，在除遠(yuǎn)紅光處理外其他光照處理下均表現(xiàn)為低表達(dá)的基因，基于Zhang 等[24]研究推測(cè)其可能不參與調(diào)控或?qū)η噍锼氐暮铣善鹨种谱饔?。而Lv 等[19]的研究也表明AaTGA2（與D 亞族AabZIP18 有1 個(gè)氨基酸差異）在幼葉與嫩芽中表達(dá)量均極低，符合對(duì)AabZIP18功能的推測(cè)。HY5轉(zhuǎn)錄因子在黃花蒿光調(diào)控途徑中具有關(guān)鍵作用，實(shí)驗(yàn)證明AaHY5 可以通過G-box 調(diào)控AaGSW1，增加CYP71AV1與AaORA的表達(dá)[27]，且AaORA也是青蒿素合成途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)CYP71AV1，ADS，DBR2及AaERF1均有激活作用[49]。H 亞族的2 個(gè)成員AabZIP40、AabZIP41注釋為HY5 轉(zhuǎn)錄因子，且均在藍(lán)光下高表達(dá)，其功能極可能對(duì)光誘導(dǎo)的青蒿素生物合成途徑起正向調(diào)節(jié)作用。

探索青蒿素的光調(diào)控機(jī)制對(duì)繼續(xù)青蒿素合成研究具有重要意義，本文通過對(duì)黃花蒿bZIP 基因家族進(jìn)行綜合分析，挖掘AabZIP在青蒿素合成途徑中重要作用，期望能為黃花蒿bZIP基因功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支持。