茯苓提取物以miR-649/Akt1通路調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲機(jī)制

姚衛(wèi) 黃偉 張斌

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類尤其是中老年人群健康的常見疾病。動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)慢性炎癥過程，也是心血管疾病致死的主要原因之一，其中血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖、遷移等是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1,2]。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可介導(dǎo)VSMCs細(xì)胞的活化、增殖、遷移等，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移對(duì)防治心血管疾病具有重要意義[3]。茯苓是中國的一種傳統(tǒng)中藥材，多用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚病等疾病的治療。楊鵬飛[4]研究顯示，桂枝茯苓膠囊可抑制血清誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖。目前，茯苓提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未知。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究顯示，miR-649在去血清處理的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增加[6]，提示miR-649可能參與調(diào)控VSMCs細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究通過AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞，探討茯苓提取物對(duì)VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，以期為動(dòng)脈粥樣硬化治療藥物的研發(fā)提供一定的新方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑 人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(HA-VSMCs)購自美國ScienCell公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、DMEM高糖培養(yǎng)基和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium，MTT)購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自美國Fermentas公司；LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；miR-649模擬物(mimics)及模擬陰性對(duì)照物、抑制劑及陰性對(duì)照序列、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，Aktl)野生型質(zhì)粒(WT-Aktl)和突變型質(zhì)粒(MUT-Aktl)，由上海吉?jiǎng)P基因公司合成；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21多克隆抗體購自多Anbo生物科技有限公司；上皮性鈣粘附蛋白(Epithelial cadherin，E-cadherin)抗體購自武漢維克賽思科技有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Akt1和磷酸化的Akt1(phosphorylated Aktl，p-Akt1)抗體購自美國Santa Cruz公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，美國Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備茯苓提取物:參照文獻(xiàn)[7]方法制備茯苓提取物。首先將茯苓中藥飲片粉碎，過200目篩。準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品，加入200 ml蒸餾水，回流提取1 h?；亓鹘Y(jié)束后，4℃、10 000 r/min離心10 min。取上清液，80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至25 ml左右。然后真空冷凍干燥處理，-20℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前，用超純水配置為含生藥量1.0 g/L的溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 VSMCs細(xì)胞培養(yǎng):VSMCs細(xì)胞用含10 % FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每2～3天更換1次新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 VSMCs細(xì)胞分組處理:VSMCs細(xì)胞分組，AngⅡ組：10-7mol/L[8]的AngⅡ作用VSMCs不同時(shí)間(24、48和72 h)；AngⅡ+茯苓提取物組：10-7mol/L的AngⅡ與不同濃度的茯苓提取物共同作用VSMCs不同時(shí)間；對(duì)照組：培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間。miR-649組：轉(zhuǎn)染miR-649模擬物；miR-NC組：轉(zhuǎn)染模擬陰性對(duì)照物；anti-miR-649組：轉(zhuǎn)染miR-649抑制劑；anti-miR-NC組：轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對(duì)照。具體轉(zhuǎn)染操作參照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明。AngⅡ+miR-649組：10-7mol/L的AngⅡ作用于轉(zhuǎn)染miR-649 mimics的VSMCs細(xì)胞；AngⅡ+miR-NC：10-7mol/L的AngⅡ作用于轉(zhuǎn)染模擬陰性對(duì)照物的VSMCs細(xì)胞。AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649組：10-7mol/L的AngⅡ與20 mg/ml的茯苓提取物共同作用轉(zhuǎn)染miR-649抑制劑的VSMCs細(xì)胞；AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC組：10-7mol/L的AngⅡ與20 mg/ml的茯苓提取物共同作用轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對(duì)照序列的VSMCs細(xì)胞。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:VSMCs細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后的6組VSMCs細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/ml的濃度接種于96孔板中，每孔200 μl。細(xì)胞貼壁后，按照上述分組處理。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h。然后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩混合均勻，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(A)。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力:VSMCs細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后的6組VSMCs細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×104個(gè)/ml。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室。下室加入500 μl含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，吸棄上室培養(yǎng)基，加入含10-7mol/L的AngⅡ和(或)20 mg/ml茯苓提取物共同作用48 h后。培養(yǎng)結(jié)束后，4%多聚甲醛固定30 min，自然晾干后，0.4%結(jié)晶紫染色15 min。然后使用倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取100 μl細(xì)胞懸液加入至鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室，剩余操作與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-649表達(dá):Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-649上游5’-TTTGGGCTACCATGTTCGG-3’；下游5’-CCGAACATGGTAGCCCAAA-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-649的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá):加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min變性后，以每孔30 μg 蛋白進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。然后將硝酸纖維素膜置于5 %脫脂牛奶中封閉，時(shí)間為2 h。加入一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。加入ELC顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):構(gòu)建Aktl野生型質(zhì)粒(WT-Aktl)和突變型質(zhì)粒(MUT-Aktl)。VSMCs細(xì)胞以5×104個(gè)/ml的濃度接種于96孔板中，每孔2 ml。代細(xì)胞融合至60 %時(shí)，分別將WT-Aktl、MUT-Aktl與miR-649 mimic、模擬陰性對(duì)照物共轉(zhuǎn)染至VSMCs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說明，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以熒光蟲活性/海腎熒光強(qiáng)度比值表示6組的熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組比較，AngⅡ組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物(10、20、50 mg/ml)組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后的活性、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，P21蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，且AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組細(xì)胞培養(yǎng)48 h的活性約為AngⅡ組的50%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 mg/ml的茯苓提取物作用細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較，AngⅡ組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)48 h后遷移和侵襲數(shù)量、MMP-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)48 h后遷移和侵襲數(shù)量、MMP-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響；A 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞遷移、侵襲的影響;B 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響;C 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表1 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖的影響

表2 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.2 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞中miR-649、p-Akt1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，AngⅡ組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)48 h后miR-649表達(dá)水平降低(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)48 h后miR-649表達(dá)水平升高(P<0.05)，Akt1和p-Akt1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞中miR-649、p-Akt1表達(dá)的影響

圖2 茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞Akt1、p-Akt1蛋白表達(dá)的影響

2.3 過表達(dá)miR-649對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 AngⅡ+miR-649組miR-649水平高于AngⅡ+miR-NC組，表明miR-649 mimics轉(zhuǎn)染成功。與AngⅡ+miR-NC組比較，AngⅡ+miR-649組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后的活性、遷移和侵襲數(shù)量、Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，P21和E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 過表達(dá)miR-649對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表4 過表達(dá)miR-649對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖的影響

表5 過表達(dá)miR-649對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4 miR-649靶向調(diào)控Akt1表達(dá) 生物信息學(xué)軟件顯示，Akt1的3’UTR含有與miR-649互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-649組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt1的熒光素酶活性降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染MUT-Akt1的熒光素酶活性物顯著變化(P>0.05)，說明miR-649可Akt1的3’UTR靶向結(jié)合。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-649組Akt1蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-649組Akt1蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 miR-649靶向調(diào)控Akt1表達(dá)；A Akt1的3’UTR含有miR-649的互補(bǔ)序列；B miR-649調(diào)控Akt1的表達(dá)

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 抑制miR-649表達(dá)能逆轉(zhuǎn)茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 與AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-NC組比較，AngⅡ+茯苓提取物20 mg/ml+anti-miR-649組VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72 h后的活性、遷移和侵襲數(shù)量、Cyclin D1、MMP-2、Akt1和p-Akt1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-649、P21和E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見圖5，表8、9。

表7 miR-649調(diào)控Akt1的表達(dá)

圖5 抑制miR-649表達(dá)能逆轉(zhuǎn)茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表8 抑制miR-649表達(dá)能逆轉(zhuǎn)茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖的影響

表9 抑制miR-649表達(dá)能逆轉(zhuǎn)茯苓提取物對(duì)AngⅡ作用的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

3 討論

研究顯示，VSMCs細(xì)胞的異常增殖、遷移可促進(jìn)血管動(dòng)脈粥樣硬化的形成，抑制VSMCs細(xì)胞的異常增殖及遷移可有效延緩血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程[9]。AngⅡ是一種血管活性物質(zhì)，可促進(jìn)VSMCs細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ作用VSMCs細(xì)胞后，VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增加，與增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白Cyclin D1和MMP-2表達(dá)升高，P21和E-cadherin蛋白表達(dá)降低，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[10]一致。作為傳統(tǒng)的中藥材，茯苓味甘、淡、性平，具有較高的藥用價(jià)值。研究顯示，茯苓提取物可通過激活線粒體介導(dǎo)的caspase途徑抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖[11]，誘導(dǎo)人白血病U937細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，茯苓提取物可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)P21和E-cadherin蛋白表達(dá)，提示茯苓提取物是潛在的治療血管動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，廣泛存在于真核生物中。研究顯示，miRNA參與VSMCs細(xì)胞的生物學(xué)特性，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用。萬正英等[13]研究顯示，miR-425可通過調(diào)控 PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈VSMCs細(xì)胞增殖和遷移，可作為血管重構(gòu)的潛在診療靶點(diǎn)。Guo等[14]研究顯示，miR-145可通過靶向負(fù)調(diào)控CD40表達(dá)抑制VSMCs細(xì)胞增殖。miR-649是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。目前，miR-649對(duì)VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和影響還未知。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ作用VSMCs細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-649表達(dá)水平降低，提示miR-649參與血管動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。過表達(dá)miR-649后，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力降低，Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)降低，而且P21和E-cadherin蛋白表達(dá)升高，表明過表達(dá)miR-649可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果還顯示，茯苓提取物作用AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞后，miR-649表達(dá)水平升高，抑制miR-649表達(dá)逆轉(zhuǎn)了茯苓提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示茯苓提取物通過上調(diào)miR-649表達(dá)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA通常與靶基因的3’UTR靶向結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為[15]。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，Akt1的3’UTR與miR-649的核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)Akt1蛋白水平證實(shí)了Akt1在VSMCs細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控Akt1表達(dá)。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等生命活動(dòng)。韓陽等[16]研究顯示，AngⅡ處理小鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞中Akt磷酸化水平升高。曹學(xué)照等[17]研究顯示，腎素前體可通過激活A(yù)kt通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖。提示Akt1參與調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究顯示，AngⅡ刺激可促進(jìn)VSMCs細(xì)胞Akt1和p-Akt1蛋白表達(dá)，而茯苓提取物可降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞Akt1和p-Akt1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明茯苓提取物通過上調(diào)miR-649表達(dá)，通過下調(diào)Akt1表達(dá)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，茯苓提取物可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制與上調(diào)miR-649表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Akt1表達(dá)有關(guān)。這為茯苓提取物治療血管動(dòng)脈粥樣硬化及心血管疾病的防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。