水蛭及其提取液在眼科疾病中的應(yīng)用和相關(guān)研究

黃 慧，鄭燕林，李園媛

0引言

2020版《中華人民共和國藥典》一部中收錄的水蛭為3種蛭的干燥全體，這種藥物性咸，味道苦，有少許毒性，主破血通經(jīng)、逐瘀消癥[1]。水蛭屬于蟲類藥，這類藥物被譽為“血肉有情之品”，在臨床中常用于活血化瘀、通絡(luò)止痛、鎮(zhèn)痙熄風(fēng)等，將蟲類作為藥物治療的歷史非常久遠，并且得到了廣泛應(yīng)用。其中在《本草綱目》中記載“咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經(jīng)血分藥，故能通肝經(jīng)聚血”。隨著科技的發(fā)展和進步，經(jīng)過不斷地研究顯示，水蛭中含有17種氨基酸以及蛋白質(zhì)，其中包括8種人體必需氨基酸[2]，另含有水蛭素、吻蛭素、組織胺以及肝素等；在水蛭中還含有糖脂類、羧酸酯類以及蝶啶類等小分子；此外也含有14種微量元素，如鋅、鐵、錳、銅、硒、鈷、鉻、鉬以及鎳等[3]。水蛭可以起到抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝、抗纖維化、抗細胞凋亡、抗腫瘤等作用[4-8]，在心腦血管疾病、腎臟疾病、整形外科中廣泛應(yīng)用。由于水蛭具有較強的活血化瘀作用，破瘀不傷新血，無損氣分，因此水蛭也可作為眼科破血逐瘀之要藥，并廣泛應(yīng)用于眼科多種疾病的治療中。

1水蛭在眼科疾病中的應(yīng)用

1.1年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)的老年性疾病，雙眼先后或同時發(fā)病，視力呈進行性損害。中醫(yī)認為ARMD的產(chǎn)生和發(fā)展與肝脾腎存在密切關(guān)系，肝脾腎功能失調(diào)是本病主要的發(fā)病機制，濕性ARMD可誘發(fā)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularisation，CNV)形成，CNV的發(fā)生是由于患者氣血津液的失調(diào)導(dǎo)致眼底水液、痰濕、瘀血等病理產(chǎn)物的堆積，在發(fā)病的全過程中，痰濕、淤血貫穿始終。仝小林教授認為水蛭為破血藥，主要應(yīng)用于絡(luò)脈瘀滯疾病[9]，所以水蛭治療ARMD主要以化痰通絡(luò)散瘀為主。孟文明[10]通過觀察活絡(luò)散結(jié)湯(方藥組成含水蛭15g)治療26例痰瘀互結(jié)證濕性ARMD的臨床療效，以視力提高1行以上為有效，發(fā)現(xiàn)治療組的有效率可達77%。唐文婷[11]采用自擬補益肝腎祛瘀湯(方劑含水蛭6g)聯(lián)合西藥治療ARMD患者42例，以治療前后視力變化、黃斑區(qū)視網(wǎng)膜厚度以及視物模糊癥狀的改善情況進行療效評定，結(jié)果顯示治療總有效率為92.9%，高于對照組(單純使用西藥治療)的75.6%，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示自擬補益肝腎祛瘀湯的應(yīng)用具有較高安全性，可長期服用。楊玉青等[12]觀察益氣養(yǎng)陰散結(jié)通絡(luò)湯(方劑含水蛭3g)治療氣陰兩虛，痰瘀阻絡(luò)證型濕性ARMD的臨床療效，觀察患者治療前后視力、30°視野及黃斑區(qū)視網(wǎng)膜厚度的改善情況，治療組總有效率76.92%，高于對照組的62.86%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示此方能明顯改善濕性ARMD患者的癥狀。

1.2糖尿病性視網(wǎng)膜病變糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的基本病理過程主要為視網(wǎng)膜微血管的病變，是糖尿病微血管并發(fā)癥之一。中醫(yī)認為DR的發(fā)病機制在于消渴日久，耗氣傷陰，以氣陰兩虛、陰陽兩虛為本，以脈絡(luò)瘀阻、痰濁凝滯為標，治療常常予以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀。由于DR歸屬絡(luò)脈病變范疇，動物藥的最大特點是動而不居，性善竄透，能深入體細道窄的絡(luò)脈之中，以深搜細剔絡(luò)中伏邪[13]，因此水蛭常用于絡(luò)脈病的治療，作用機制可能在于改善微循環(huán)等。國內(nèi)外研究也表明天然水蛭素可能通過阻斷PARS/p38/NF-κB等途徑降低大鼠皮瓣炎癥反應(yīng)，具有改善微循環(huán)的潛能[14-15]。臨床使用含水蛭的中成藥治療非增殖期DR的療效已取得了一定的進展，如芪明顆粒(成分：水蛭、黃芪、葛根、地黃、枸杞子、決明子、茺蔚子、蒲黃)。一系列的臨床試驗發(fā)現(xiàn)芪明顆粒能夠提升非增殖期DR患者的視力，改善黃斑水腫情況，使視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜的血流加快，眼部血液循環(huán)得到改善，延緩DR的進展，且療效安全，不良反應(yīng)發(fā)生率低[16-19]。

1.3白內(nèi)障白內(nèi)障(cataract)的發(fā)生機制較為復(fù)雜，任何影響眼內(nèi)環(huán)境的因素都可以直接或間接破壞晶狀體的組織結(jié)構(gòu)，其中晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)過度凋亡是年齡相關(guān)性白內(nèi)障產(chǎn)生的原因之一[20]。中醫(yī)則認為白內(nèi)障的發(fā)病機制在于年老肝腎虧虛，精血不足，或因脾胃虛弱，肝熱上擾致晶珠逐漸混濁。目前與水蛭相關(guān)的藥物治療白內(nèi)障多與LECs相關(guān)，由福建省第二人民醫(yī)院研制的復(fù)方水蛭滴眼液(SZ)是以民間驗方為基礎(chǔ)，以水蛭為主要成分，目前已經(jīng)獲得專利權(quán)，SZ可減緩實驗大鼠半乳糖白內(nèi)障，其作用機制在于減輕因紫外線照射引起的LECs損傷，提高LECs核內(nèi)的DNA含量，從而起到防護紫外線照射引起LECs凋亡的作用[21]。在一項為期6mo的SZ治療年齡相關(guān)性白內(nèi)障100眼的臨床觀察中，以矯正視力和晶狀體混濁程度為療效觀察指標，結(jié)果顯示SZ組有效率(66%)明顯高于對照組(2%)(P<0.01)，且只有少數(shù)患者出現(xiàn)了不良反應(yīng)，說明了其用藥的安全性[22]。

1.4視網(wǎng)膜靜脈阻塞視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)的發(fā)病率僅次于DR，是較為常見的視網(wǎng)膜血管疾病，黃斑水腫和視網(wǎng)膜新生血管出血是RVO眼視力喪失的兩個主要原因。中醫(yī)臟腑學(xué)說認為RVO多因痰熱內(nèi)生，氣滯血瘀，或因脾胃虛弱，脾不統(tǒng)血引起的血溢脈外，或因陰虛陽亢、氣血逆亂，血不循經(jīng)而溢于目內(nèi)；以經(jīng)絡(luò)學(xué)說來看，目絡(luò)為絡(luò)脈在眼部的延伸，具有滲灌氣血、聯(lián)系臟腑的作用，“以通為用”是目絡(luò)重要的生理特點[23]，因此視網(wǎng)膜阻塞性血管疾病療法主要以通為主，兼以益氣養(yǎng)陰。水蛭善破血逐瘀，通絡(luò)散結(jié)，因此中藥水蛭對于視網(wǎng)膜缺氧缺血性的血管病變具有良好的活血通絡(luò)作用，有助于眼底出血后的吸收、黃斑水腫的減輕以及預(yù)防新生血管的形成。在一項中醫(yī)臨床試驗中，采取分期治療RVO，并對治療效果進行觀察顯示，采用“化瘀散結(jié)片(成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科研制并以水蛭為主藥)”配合“益視片”治療RVO干血期或者死血期，試驗組療效優(yōu)于對照組[24]。另有研究顯示應(yīng)用眼絡(luò)通方(由水蛭、地龍、葛根、川芎、三棱組成)治療兔RVO模型，兔視網(wǎng)膜組織中各時間點血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA及蛋白表達量均較模型對照組顯著降低，推測其抑制新生血管形成的作用機制可能與下調(diào)VEGF和PDGF在視網(wǎng)膜組織中的高表達有關(guān)[25]。

1.5其他眼科疾病研究發(fā)現(xiàn)化瘀散結(jié)片(以水蛭為主藥)可以促進玻璃體積血吸收，對防治增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreous retinopathy，PVR)的發(fā)生發(fā)展有一定作用[26-27]?；錾⒔Y(jié)片也能運用在視網(wǎng)膜脫離術(shù)后的視功能恢復(fù)，治療組服用化瘀散結(jié)片治療1、3mo后的視力療效顯效率分別為51.61%和58.06%，且治療3mo后治療組顯效率明顯高于對照組，說明化瘀散結(jié)片能有效改善視網(wǎng)膜脫離術(shù)后患者的玻璃體混濁，加快視網(wǎng)膜下積液吸收，促進視網(wǎng)膜平伏，有利于視功能的恢復(fù)[28]。

此外，由于蟲類藥物具有通經(jīng)活血、化痰散結(jié)的作用，一些學(xué)者認為水蛭對甲狀腺相關(guān)眼病也有著不錯的療效。陳如泉教授認為甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機制在于肝氣郁久化火，痰瘀互結(jié)，或因肝脾不和，脾虛水濕聚而成痰，日久循經(jīng)上行于目，痰血瘀阻于眼眶，水蛭破血逐瘀，能軟堅散結(jié)，配合其他活血通絡(luò)類藥物可共奏化痰散結(jié)之功效[29]。但水蛭在甲狀腺眼病的臨床應(yīng)用未進行確切的療效評估，需要做進一步的臨床試驗來觀察其療效是否可靠。

2水蛭提取液在眼科中的研究現(xiàn)狀

目前水蛭提取液在眼科基礎(chǔ)研究中常見有3種提取方式：(1)水蛭滲濾液[30]：水蛭粗粉定量，加體積分數(shù)75%乙醇200mL，使均勻潤濕，加蓋，放置2h，裝入滲濾筒中，添加體積分數(shù)75%乙醇高出藥面3cm，排除筒內(nèi)空氣。加蓋放置48h后放出藥液，流速3mL/min，并從藥面不斷添加體積分數(shù)75%乙醇5000mL，滲濾液回收乙醇至無醇味，定容至實驗所需量，藥液經(jīng)60Co照射滅菌，備用。(2)水蛭水提醇沉提取液[31]：取水蛭定量，加水煮3次，每次加水8倍，煎煮1h，濾過，合并3次濾液，濃縮至200mL，加95%乙醇，使含醇量至75%，靜置過夜，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，定容，藥液經(jīng)60Co照射滅菌，備用。(3)水蛭水提液[32]：水蛭干粉直接溶于PBS中，按一定比例混合浸提30min，濾過后備用。對于以上3種水蛭提取物的濃度均是根據(jù)《中華人民共和國藥典》中使用凝血酶測定水蛭提取液中水蛭素的濃度來計算。

2.1水蛭滲濾液

2.1.1對新生血管的調(diào)控作用有研究顯示，64g/L水蛭滲濾液會導(dǎo)致RF-6A血管內(nèi)皮細胞跨膜受體VEGFR2的表達大幅降低，抑制了血管內(nèi)皮細胞增殖，推測可能是因為水蛭滲濾液與VEGFR2有相互作用，競爭性抑制了VEGF與VEGFR2的結(jié)合[33]。在之后的一項實驗中發(fā)現(xiàn)凝血酶能夠在2、4、6、8、10h誘導(dǎo)RF-6A細胞TNF-α表達的增加，而64g/L水蛭滲濾液能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)下TNF-α的表達，推測水蛭滲濾液通過阻斷凝血酶從而對視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞TNF-α表達下調(diào)，減少新生血管的生成[34]。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與新生血管的產(chǎn)生密切相關(guān)，其中研究最多的是MMP-2，64g/L水蛭滲濾液作用于RF-6A細胞，以MMP-2和Ⅳ型膠原為檢測指標，結(jié)果顯示64g/L水蛭滲濾液促進了體外凝血酶誘導(dǎo)下細胞微環(huán)境中Ⅳ型膠原的合成，抑制了MMP-2的分泌，改變了細胞生長的微環(huán)境，對新生血管的形成有抑制作用[35]。也有研究發(fā)現(xiàn)天然水蛭素在低濃度時可促進血管生成，而在高濃度時可抑制血管生成[33]，提示水蛭滲濾液對血管內(nèi)皮細胞的生成可能有著一定調(diào)控作用，主要在于減少VEGF和TNF-α等促血管生成因子的表達，抑制MMPs等酶的分泌，改變細胞生長的微環(huán)境，從而抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，對新生血管的產(chǎn)生有著一定的影響。

2.1.2抗增生作用由于視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)是參與PVR的主要細胞之一，RPE受到不同刺激，重新進入細胞周期，使RPE異常增殖造成PVR的發(fā)生。鄭燕林等[36]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度凝血酶均有不同程度促進RPE增殖作用，128mg/mL水蛭滲濾液對凝血酶誘導(dǎo)的RPE增殖具有抑制作用。一系列的研究發(fā)現(xiàn)水蛭滲濾液對RPE抑制的作用機制可能與P38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及G蛋白信號通路等有關(guān)[37-38]。Bastiaans等[39]通過研究得出結(jié)論，天然水蛭素可以顯著降低增生性玻璃體病變患者玻璃體內(nèi)凝血酶活性，抑制RPE促炎和促纖維化途徑。這與水蛭素發(fā)揮抗凝的功效基本一致，因此我們推測水蛭滲濾液發(fā)揮抗增生作用機制的有效成分之一為水蛭素。

2.1.3轉(zhuǎn)分化作用本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)64g/L水蛭滲濾液可在體外誘導(dǎo)RPE形態(tài)類似神經(jīng)元樣細胞改變，并表達神經(jīng)元特異性蛋白NSETIN，提示水蛭有誘導(dǎo)體外RPE向神經(jīng)元分化的趨勢[40]，因此水蛭具有調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細胞活性及定向分化作用，并將分化細胞進行視網(wǎng)膜下腔移植來治療退行性視網(wǎng)膜病變等是具有研究前景的。但由于水蛭的成分十分復(fù)雜，水蛭滲濾液發(fā)揮轉(zhuǎn)分化作用機制的有效成分尚不明確，仍需做更深入的探索。

2.2水蛭水提醇沉提取液LECs與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，LECs的過度凋亡或者異常增殖均可能引起不同類型的白內(nèi)障發(fā)生。周春陽等[31]通過觀察體外培養(yǎng)LECs，模擬白內(nèi)障囊外摘除術(shù)[extra capsular cataract extraction (cataract surgery)，ECCE]術(shù)后后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)水蛭水提醇沉提取液對體外培養(yǎng)的牛LECs有明顯生長抑制作用，其24、72h ID50分別為31.85、30.69mg/mL，經(jīng)比較差異無顯著性(P>0.05)，且經(jīng)作用24h后，觀察到水蛭水提醇沉提取液能抑制LECs的貼壁，這為水蛭用于防治后發(fā)性白內(nèi)障提供了實驗依據(jù)。重組水蛭素與天然水蛭素的結(jié)構(gòu)、藥理作用高度相似[41]，孫宇等[42]研究發(fā)現(xiàn)重組水蛭素經(jīng)眼部黏膜給藥后可以使半乳糖性白內(nèi)障大鼠的晶狀體混濁度減輕，可能是由于提高了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低了晶狀體中過氧化產(chǎn)物—丙二醛(MDA)濃度，LECs細胞膜穩(wěn)定性和抗脂質(zhì)過氧化能力逐漸恢復(fù)，從而達到預(yù)防和治療白內(nèi)障的效果。重組水蛭素變異體Ⅲ(rHV3)對半乳糖介導(dǎo)的LECs損傷均具有較好的保護作用，rHV3能夠顯著降低高糖環(huán)境下LECs的p53表達，其抗細胞凋亡作用的機制之一是通過p53抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來起到對LECs的保護作用[43-44]。水蛭水提醇沉提取液具有抑制LECs生長的作用，而重組水蛭素以及其變異體具有抗LECs凋亡的作用，推測水蛭的不同提取方法可能影響其有效成分發(fā)揮不同的藥理作用，但其中具體的作用機制尚待進一步證實。

2.3水蛭水提液由于水蛭素具有強大的抗凝血功能，故有利于藥物進入組織殺滅腫瘤細胞。李園媛等[32]使用水蛭素濃度為0.04、0.08U/mL的水蛭水提液體外作用于人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞(WERI-RB-1)，對細胞的增殖、凋亡以及侵襲能力進行檢測，研究結(jié)果表明水蛭水提液可以有效抑制WERI-RB-1細胞的增殖和侵襲，并能誘導(dǎo)細胞凋亡，有望能成為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療藥物，但其分子機制還需深入研究。

3小結(jié)與展望

中藥水蛭的功效多為破血通經(jīng)、逐瘀消癥，因此水蛭目前在眼科疾病中多用于各種血證的治療，其發(fā)揮作用的機理主要為抗VEGF、改善微循環(huán)障礙、抗細胞凋亡以及抗增生等，通過臨床研究數(shù)據(jù)顯示均取得了一定療效。對水蛭提取液的研究也在不斷深入與創(chuàng)新，如水蛭提取液可能誘導(dǎo)細胞分化、水蛭水提液可以有效抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖等，這為中藥發(fā)揮其多元化的特性治療視力喪失性眼科疾病提供了更多方向。

然而，由于中藥成分的復(fù)雜性，水蛭及其提取液的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究依然存在許多問題：(1)水蛭入藥治療眼病以復(fù)方和中成藥為主，中藥復(fù)方等成分組成極其復(fù)雜，因此不能判定發(fā)揮作用機制的主要藥物是否為水蛭，水蛭的有效成分組成至今未得到完全解釋；(2)水蛭的提取方式有多種，前期的研究顯示不同的提取方式可能使水蛭發(fā)揮不同的藥理作用，但目前水蛭的提取方式尚缺乏標準的質(zhì)量控制體系，因此不能確定水提取液的穩(wěn)定性和絕對有效性；(3)水蛭古今醫(yī)書均記載有毒，在《本經(jīng)》中列為下品，雖據(jù)現(xiàn)代藥理研究較為安全可靠，但在臨床應(yīng)用時其用量安全問題仍未得到完全解決。因此未來對于水蛭的研究應(yīng)該注重其成分分析，形成較為標準的中藥質(zhì)量控制體系，使水蛭發(fā)揮作用的機制得到更全面的闡釋，提高水蛭應(yīng)用的安全性和有效性。