中藥中黃曲霉毒素的研究進展＊

張曉萍，劉笑笑，苗 菊

（1.蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000）

中醫(yī)藥體現(xiàn)了中華民族的博大智慧，隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中藥材的需求和使用量日益攀升，同時中藥的安全性問題也受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，其中真菌毒素殘留引起中藥材及其制品質(zhì)量發(fā)生變化是主要因素之一。研究表明，黃曲霉毒素具有很強的毒性和致癌性，中藥材在其種植、采收、運輸和貯藏過程中，每個環(huán)節(jié)都可能因為操作方法不當而被黃曲霉毒素污染，從而導(dǎo)致大量黃曲霉毒素的生長和積累，這將直接影響中藥的質(zhì)量與療效，極大地危害著人們的身體健康，并且使中藥的質(zhì)量與使用安全得到了限制。目前，對于食品中黃曲霉毒素的相關(guān)研究較多，并且在防控措施、限量標準等方面都做了規(guī)定，但對中藥中黃曲霉毒素污染的系統(tǒng)研究尚不夠深入。因此，關(guān)注中藥材、中藥飲片及其制劑中黃曲霉毒素的污染狀況，對中藥的安全性保證有著不容忽視的意義。對黃曲霉毒素的危害及中藥中黃曲霉毒素的分析技術(shù)的研究進展進行綜述，并進行相關(guān)的展望，以期為黃曲霉毒素的準確測定提供參考。

1 黃曲霉毒素概況

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉素（Aspergillus flavus）和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)毒素，是一類真菌毒素[1]，迄今為止已發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物有20 余種，分別命名為A1、B2、B2a、B3、G1、G2、G2a、M1、M2、M2a、Re、P1、Q1、毒醇H 等[2]，其基本結(jié)構(gòu)是一個氧雜萘鄰?fù)鸵粋€雙氫呋喃環(huán)，前者通常被認為與致癌作用有關(guān)，后者是毒性結(jié)構(gòu)，其代謝產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)上十分接近，目前化學(xué)結(jié)構(gòu)已明確的有12 種[3]，目前研究較多的是B 族，G 族，M 族的B1，B2，G1，G2，M1，M2，其化學(xué)分子式分別為C17H12O6、C17H14O6、C17H12O7、C17H14O7、C17H12O7、C17H2O7，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最為劇烈，其毒性約是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍，肝毒性和致癌性也最強，極毒量為1000μg/kg，可致人死亡[4]；1993 年，世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)把AF 劃定為一類致癌物，屬于劇毒物質(zhì)[5]?！吨腥A人民共和國藥典》2015 年版規(guī)定了陳皮、蓮子、桃仁、僵蠶、大棗、地龍等19 味藥材的黃曲霉毒素限量，限度為黃曲霉毒素B1不得超過5μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的總量不得超過10μg/kg，規(guī)定的凈化方式為免疫親和柱凈化，高效液相色譜或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測。

2 中藥中黃曲霉毒素前處理分析技術(shù)

前處理是對樣品進行分析的主要步驟，此過程所需的時間較長，一個正確的前處理方法直接影響著檢測結(jié)果的準確性和靈敏度，同樣，此過程也容易對測量結(jié)果造成誤差。由于中藥樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,以及其所含黃曲霉毒素含量高低的影響,在儀器分析前采取適當?shù)臉悠非疤幚砑夹g(shù)對目標物進行提取、凈化是很有必要的[6]。

2.1 提取方法

進行一次效果較好提取的前提是，提取充分且所提取物質(zhì)中含有的非目標組分盡量少，這將有利于進行后續(xù)的分離和純化。黃曲霉毒素寄生在中藥基質(zhì)的各個角落，需要不同提取方法進行提取。目前常用的提取方法主要有振搖提取法、超聲提取法、高速均質(zhì)提取法等［7］。

振搖提取法是一種最基本的提取方法，其優(yōu)點是樣本稀釋后會大幅度增加液體的流動性，從而使提取效率得到提高，且使樣本不被破壞，但對于不同基質(zhì)的中藥黃曲霉毒素，其提取率差別較大。楊小麗等［8］測定動物類藥材中的黃曲霉毒素，樣品提取采用振搖提取法，在水平搖床上振搖提取40 分鐘，免疫親和柱凈化后用HPLC-FID 測定，結(jié)果黃曲霉毒素的平均回收率為78.8%～106.7%。

高速均質(zhì)提取法是借助于均質(zhì)機器，將樣品與提取溶劑混合后高速旋轉(zhuǎn)，使兩者充分接觸，從而將中藥中的黃曲霉毒素提取出來。但是高速攪拌可能會破壞提取物的分子結(jié)構(gòu)。

超聲提取法是利用超聲波的一系列作用與效應(yīng)使細胞內(nèi)有效物質(zhì)快速釋放、擴散和溶解，以此來提高提取效率，但由于此法破碎力較強，所以雜質(zhì)也較多。周穎等[9]用固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法測定益母草中的7 種真菌毒素，對比考察了超聲和均質(zhì)兩種提取方式，結(jié)果表明，超聲和均質(zhì)提取的回收率基本相當。

2.2 凈化方法

凈化樣品是黃曲霉毒素分析中的重要步驟，凈化是指在檢測前，為了提高檢測結(jié)果的靈敏度，在不損失或盡量少的損失待測黃曲霉毒素的前提下，去除干擾雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、色素等的過程。由于中藥基質(zhì)的不同，以及所含毒素微量的原因，樣品的凈化也是測定黃曲霉毒素的難點所在。目前常用的凈化方法主要為免疫親和柱凈化法、固相萃取柱凈化法及QuEChERS 法等。

免疫親和層析(Immune Affinity Column，IAC)法的原理是抗原抗體反應(yīng)，免疫親和柱內(nèi)連接著抗體，樣本中經(jīng)過提取的黃曲霉毒素，在通過含有AFT特異抗體的免疫親和柱時，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析遞質(zhì)中的抗體上[10]。這種凈化方法操作簡便，特異性和選擇性強，且回收率高，但價格昂貴?！吨腥A人民共和國藥典》2015 版四部黃曲霉測定法規(guī)定黃曲霉毒素的凈化采用此方法［11］。張玉蓮等[12]選用免疫親和柱凈化，HPLC-FLD 法測定天麻藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。結(jié)果表明，該檢測方法線性關(guān)系良好(r＞0.9985)，回收率在87%～108%之間。B1、B2、G1、G2的精密度分別為1.3%、0.9%、3.5%、2.9%,檢出限分別為0.23μg/kg、0.15μg/kg、0.44μg/kg、0.30μg/kg。

固相萃取柱 (SPE，Solid Phase Extraction)凈化法的原理是選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法。慣用的方法是使待測樣品溶液通過固相萃取小柱，先使被測組分被吸附，然后再使用適宜強度的溶劑沖洗，除去其余雜質(zhì)，最后用少量溶劑洗脫被測組分；也可以讓被測物流出而選擇性的吸附干擾雜質(zhì)，或?qū)烧咄瑫r被吸附，再使用合適的溶劑選擇性洗脫被測物質(zhì)。但此法的缺點是專一性差，不能充分凈化痕量黃曲霉毒素。Han 等[13]用0.9g 的氧化鋁和1.6g 的硅膠為填料，自制一種多功能凈化柱，用于中藥中6 種黃曲霉毒素的凈化，采用HPLC-MS 測定，結(jié)果6 種黃曲霉毒素的平均回收率為85.6%～117.6%，相對平均偏差為1.3%～16.1%。

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe) 法原理與固相萃取 (Solid Phase Extraction，SPE)、高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)原理相似，都是利用吸附劑吸附雜質(zhì)的原理，從而達到凈化的目的，主要用于痕量組分的分析。QuEChERS 方法操作簡單，分析速度快，精確度和準確度高，溶劑使用量少且乙腈加入后密閉，對操作人員的安全性高，污染小，但去除雜質(zhì)的效果較差是其缺點。操作步驟可以簡單的歸納為:①樣品粉碎；②加入乙腈提取、分離；③加入硫酸鎂等鹽類除水；④加入乙二胺-N-丙基硅烷等吸附劑去除雜質(zhì)；⑤上清液進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。李春等[14]將何首烏粉碎后的藥粉中加入水、經(jīng)驗證的提取效果最好的含1%乙酸的乙腈溶液渦旋，再加入4 種固體試劑，超聲處理，檢測4 種AF 類毒素，同時驗證了此法為集提取、凈化為一體的方法，在很大程度上節(jié)省了檢測時間。

3 黃曲霉毒素的檢測技術(shù)

黃曲霉毒素的檢測從最開始的以薄層色譜掃描法（TLC）為主，發(fā)展到了用高效液相色譜法（HPLC）來檢測，再到免疫學(xué)方法等，這些進展都和新儀器、新的化學(xué)檢測技術(shù)的應(yīng)用密不可分。這些新的檢測分析方法的快速應(yīng)用，使得黃曲霉毒素的測定有了更多的選擇機會，也為不同檢測目的提供了更多適宜的檢測方法。目前采用的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。

3.1 薄層色譜法

薄層色譜法是用來測定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法之一，在1990 年時被收錄在AOAC 標準中，這種檢測方法的原理是利用黃曲霉毒素或其代謝產(chǎn)物在固定相和流動相中的有很大的分配系數(shù)的差異，將待測樣品通過提取、過柱、層析、洗脫、濃縮、薄層等一系列的方法進行分離，然后在365nm 的紫外波長下，使黃曲霉毒素產(chǎn)生特定顏色的熒光，最后將檢測出來的熒光與標準品的熒光進行比較，從而測定黃曲霉毒素的量，不同的衍生物分別顯示不同的熒光[15]。TLC 法所需設(shè)備簡單，費用低，但由于其提取物易含較多雜質(zhì)且前處理繁瑣，特異性和靈敏度較差，且測定黃曲霉毒素專一性不夠，已經(jīng)越來越不適合當前時代分析的要求了[16]，目前多用于黃曲霉毒素化學(xué)分析法的一般佐證。

3.2 高效液相色譜法（HPLC）及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC—MS）

高效液相色譜法（HPLC）的檢測原理是基于高效液相色譜儀加柱后衍生系統(tǒng)進行分離，然后用熒光檢測器（FLD）進行檢測。HPLC 檢測，在確保準確度的前提下，還具有快捷、穩(wěn)定和靈敏的優(yōu)點，是目前常用來檢測黃曲霉素的方法之一[17]。基于對B1，G1 靈敏度不高，所以采用反相液相色譜法（RPLC）來測定。RPLC 系統(tǒng)易操作，流動相毒性低，且不易受沸點，熱穩(wěn)定性和分子量等的限制，可同時分析樣品中不同的黃曲霉素衍生物，如B1、B2、G1、G2、M1，近幾年內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用[18]。但是其柱前柱后衍生分析時間長，易出現(xiàn)假陽性。對于柱前的衍生，可用免疫親和柱和HPLC 聯(lián)用，比單用的效果更佳，柱后的衍生可用LC—MS。

LC—MS 是最近幾十年來發(fā)展起來的檢測技術(shù)，是一種集高效分離與多組分定性、定量于一體的聯(lián)用檢測技術(shù)，這種聯(lián)用檢測技術(shù)在HPLC 原有快速、靈敏、準確的基礎(chǔ)上，很大的提高了檢測的靈敏性及檢測結(jié)果的特異性。由于其能夠精確檢測黃曲霉素含量的特點，是目前為止最權(quán)威的檢測技術(shù)[19]。這種技術(shù)的發(fā)展使得對復(fù)雜物質(zhì)的成分分離與檢測向著高效率和高可靠性的方向發(fā)展。李洪波[20]等采用了高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法來測定玉米中的AFB1，其測定結(jié)果顯示，黃曲霉素在不同種的玉米樣品中的檢測限為0.5μg/kg，在0.2～5.0ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。雖然此種方法有著顯著的優(yōu)勢，但因為其設(shè)備操作復(fù)雜，對操作人員要求高，且儀器價格昂貴，這成為一直以來阻礙此種檢測方法普遍使用的原因。

3.3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是目前比較有效的用來檢測黃曲霉毒素的方法，其檢測方法的種類分類很多，以下介紹幾種經(jīng)常用來檢測黃曲霉毒素的方法，包括金標免疫層析法（GICA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、微柱篩選法。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是于20 世紀70 年代新開發(fā)出來的用于檢測病毒的免疫檢測技術(shù),是由瑞典學(xué)者ENGVALL 和PERLMAN，荷蘭學(xué)者VAN WEEMAN 幾個人最早同時提出的[21]。在這種方法的使用初期，主要用來檢測病毒,到了70 年代中后期的時候才逐漸應(yīng)用到了真菌毒素的檢測方面[22]。ELISA 的檢測原理是，抗原或抗體吸附劑與用酶標記的抗體或抗原和標本中的待測物發(fā)生特異的免疫學(xué)反應(yīng)，然后用測定酶活力的方法來增加此種檢測方法的敏感度[23]。常用雙抗體夾心和競爭法來測定黃曲霉素的含量[24]。其優(yōu)點是檢測速度快，強特異性，提取步驟簡便，成本較低，特別適用于監(jiān)測黃曲霉毒素污染的大量樣品的篩查。但由于酶本身具有的性質(zhì)，其活性易受各種反應(yīng)條件的影響，從而導(dǎo)致其測定結(jié)果的重復(fù)性不好，容易有假陽性的問題，因此在測定時要對反應(yīng)條件做一些特殊處理。

免疫層析法是于20 世紀80 年代初出現(xiàn)的用于快速檢測的免疫技術(shù)，該法操作簡單、方便、快捷，不需任何特殊的儀器設(shè)備，非常適合大量樣品的初篩和現(xiàn)場測試。金標免疫層析法則是將色譜層析技術(shù)和膠體金免疫技術(shù)同時結(jié)合，利用待檢樣品中的黃曲霉毒素代謝物B1 與膠體金表面的抗黃曲霉毒素B1 單克隆抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，以此來對黃曲霉毒素進行檢測[25，26]。這種檢測方法能在短時間內(nèi)就可以檢測出被測物中黃曲霉毒素的濃度，并可以直接讀取其結(jié)果。可以一步檢測是這種方法最大的優(yōu)點，檢測方便且效率高。

微柱法檢測黃曲霉素是基于微柱管內(nèi)的吸附劑（硅鎂型）可以吸附黃曲霉毒素，并且其在紫外(UV)365nm 的下顯示特定顏色的熒光，在一定的濃度范圍內(nèi)，黃曲霉毒素的含量與測定的熒光強度成正比關(guān)系，以此來粗略測定黃曲霉毒素含量[27]。肖志軍等人[28]對親和柱進行了研究，結(jié)果表明使用不同的微柱，加標回收率在80.0%～91.5%之間，不同批次加標回收率無顯著差異。但選用微柱篩選法來測定黃曲霉毒素的含量時，只能測定，其總量，而不能分離測定幾種代謝物的量。

3.4 其他方法

除了上述所述的幾類檢測方法外，仍有許多方法用于黃曲霉毒素的檢測。如超光譜法（HS），超光譜法的原理是，先通過特定的光源激發(fā)需要檢測樣品，然后通過儀器捕捉使之成像，再對最后所成像進行抽取，并依據(jù)特征排列，以此來實現(xiàn)對黃曲霉毒素污染的樣品和未被黃曲霉毒素污染的樣品的區(qū)分[29]。超光譜法具備準確、快速、無損待測物的特點，此檢測方法對于我們發(fā)展更優(yōu)的檢測技術(shù)是至關(guān)重要的。

4 總結(jié)與展望

黃曲霉毒素的高毒性、高致癌性，以及難以通過高溫除去的特性，決定其對人類的健康造成嚴重的危害，隨著人們對黃曲霉毒素認識水平的提高，消費者對藥品安全意識的增加，黃曲霉毒素及一些相關(guān)的菌株所引起的安全問題必將越來越受到人們的關(guān)注與重視。因此，發(fā)展和建立一些安全、快速、有效、經(jīng)濟的檢測方法變得尤為重要。我國用來檢測黃曲霉毒素的高效液相色譜法(HPLC)，檢測限值低且檢測結(jié)果準確，但由于在檢測過程中需要用到一些對人體有毒有害作用的試劑，會對檢測人員的身體造成危害。薄層色譜法(TLC)作為傳統(tǒng)的檢測方法之一，與液相色譜法一樣，會對檢測的人員健康造成危害。因此，未來檢測技術(shù)的發(fā)展方向應(yīng)該同時具備檢測結(jié)果的準確和安全兩大特性。

隨著黃曲霉毒素特異性抗體的研制成功，使得高質(zhì)量抗體獲得容易，從而使利用抗原抗體反應(yīng)而設(shè)計的免疫傳感器得到快速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，它具有操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點，這將非常適合天然食品現(xiàn)場的快速定量、定性檢測。目前，還有將發(fā)展迅猛的生物技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合起來的檢測方法，必定極大地的影響黃曲霉毒素和各種致病微生物的測定，這都將在近幾年的研究中越來越得到重視，同時也會成為黃曲霉毒素檢測技術(shù)未來發(fā)展的趨勢[30]。此外，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，表面增強拉曼散射(SERS)技術(shù)被普遍的應(yīng)用于微量物質(zhì)的檢測，以表面增強拉曼散射技術(shù)為基礎(chǔ)的黃曲霉毒素檢測方法，具有結(jié)果準確、檢測快速、樣品需要數(shù)量少的優(yōu)點，適用于痕量物質(zhì)的分析檢測，是今后黃曲霉素檢測分析技術(shù)發(fā)展的趨勢所在[31]，所以有希望在未來的某一天發(fā)展一個受約束小且高效的黃曲霉毒素檢測技術(shù)。