分子生物學(xué)方法在腸球菌耐藥性研究中的應(yīng)用

郭嬪

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

0 引言

腸球菌屬于一種革蘭陽性菌，其發(fā)生感染率僅次于葡萄球菌，人體感染腸球菌之后很有可能會(huì)導(dǎo)致傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、腹膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎等疾病。而且目前萬古霉素耐藥腸球菌正在逐漸增加，所以臨床上在治療以上類型疾病的過程當(dāng)中也存在著較大的困難。目前，我國對(duì)腸球菌耐藥性的研究已經(jīng)到達(dá)了分子水平，所以分子生物學(xué)方式是研究腸球菌耐藥性的主要方式之一，本文就針對(duì)分子生物學(xué)方法在腸球菌耐藥性研究中的應(yīng)用進(jìn)行了分析，以下為具體內(nèi)容。

1 飛行時(shí)間質(zhì)譜和聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)主要是一種能夠在人體外模擬自然DNA復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)，我國實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行腸球菌屬鑒定的過程當(dāng)中主要通過生化實(shí)驗(yàn)鑒定表型，其中主要包括API法和VITEK革蘭陽性菌鑒定系統(tǒng)[1]。各種方式能夠在24小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，但是可靠性相對(duì)不夠，主要的原因是由于非典型的種屬和目前生化試驗(yàn)設(shè)計(jì)無法相一致，或者試劑盒對(duì)于新種屬并沒有建立一個(gè)新的鑒定方式，針對(duì)這個(gè)問題，分子生物學(xué)方法就能夠解決。目前通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的方式可以有效快速的鑒定腸球菌屬，而且所耗費(fèi)的成本也比較低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。為了建立腸球菌van的基因分型和鑒定方法，gurtler等人發(fā)展了兩種可用于高分辨率融合曲線pcr（hrmpcr）技術(shù)的多重pcr反應(yīng)，檢測(cè)不同種類的van基因，得到特異性的曲線。

2 Southren雜交技術(shù)

Southren雜交技術(shù)主要是在1975年被提出來的，相關(guān)的操作步驟比較復(fù)雜，但是在進(jìn)行VRE研究的過程當(dāng)中，可以依照《分子克隆》的相關(guān)步驟結(jié)合自身試驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)就可以進(jìn)行了[2]。Southren雜交技術(shù)還可以進(jìn)行vanA基因的鑒定，一般來說vanA基因存在于腸球菌的質(zhì)粒上，鑒定的時(shí)候可以通過提取腸球菌質(zhì)粒的DNA，通過限制性內(nèi)切酶RCORI消化質(zhì)粒DNA，設(shè)計(jì)出有關(guān)vanA基因的探針，隨后進(jìn)行Southren雜交技術(shù)就能夠確定vanA基因的位置。Southren雜交技術(shù)還能夠構(gòu)建一個(gè)腸球菌質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖譜，針對(duì)不同的耐藥基因可以設(shè)計(jì)出不同的特異性引物，隨后進(jìn)行Southren雜交技術(shù)的探針，通過定位就可以確定耐藥基因在限制性內(nèi)切酶圖譜的位置。

3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳主要是一種應(yīng)用在分離大分子量線狀DNA中的方式，一般來說腸球菌PFGE的周期在5~7天[3]，所以進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳的方式主要分成了四個(gè)步驟。第一，進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的制備，主要包括收集菌體、增菌、低熔點(diǎn)瓊脂糖制作細(xì)菌包埋膠塊、蛋白酶K消化、溶菌酶溶解細(xì)菌細(xì)胞壁、多次加洗液等，以上制備工作主要花費(fèi)3天左右，通過包埋膠塊的方式可以將細(xì)菌在4℃下保存1個(gè)月。第二，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切。選擇Smai腸球菌，在25℃的水中浸泡一夜。第三，進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。選擇實(shí)驗(yàn)室需要的儀器，由于不同儀器的電泳條件是不同的，所以可以進(jìn)行事先預(yù)實(shí)驗(yàn)。一些學(xué)者先通過伯樂公司CHEF Mapper system 的PFGE儀器，該儀器的電泳條件為1g/dl瓊脂糖，0.5%×TBE buffer，時(shí)間調(diào)整為1~23s。實(shí)驗(yàn)的過程中必須要重視脈沖場(chǎng)凝膠電泳這一步驟，這一步驟雖然看似簡(jiǎn)單，但是是決定整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功與否、準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵，主要原因是在進(jìn)行電泳的時(shí)候，DNA會(huì)隨著活動(dòng)的進(jìn)行而出現(xiàn)降解的問題，從而導(dǎo)致條帶模糊或者不存在條帶情況的出現(xiàn)，針對(duì)這個(gè)問題可以在配置電泳液的時(shí)候加入100μmol/L的硫尿[4]。第四，進(jìn)行溴化乙錠染色和成像。這個(gè)步驟所耗費(fèi)的時(shí)間周期比較長，所以要提高重視程度。

在進(jìn)行流性疾病研究的時(shí)候，為了節(jié)省時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)判斷出是否存在VRE爆發(fā)的情況，可以通過改進(jìn)的快速分型法進(jìn)行VRE的PFGE工作。主要包括以下幾種步驟。第一，50mmol/L Tril HCI（PH80），50mmol/L EDTA，1250U/ml變?nèi)芫兀?5mg/ml溶菌酶，15mg/ml蛋白酶K，環(huán)境條件為37℃，時(shí)間為10分鐘。第二，0.5mol/L DTA，1g/dl十二烷基肌氨酸鈉，400μg/ml蛋白酶K，環(huán)境條件為55℃，時(shí)間為2小時(shí)，水洗，50℃水洗10分鐘，一共操作3次。TE洗，環(huán)境條件為50℃，時(shí)間為10分鐘，次數(shù)為3次。第三，Smai（30U），25℃酶切，時(shí)間為2小時(shí)。第四，電泳時(shí)間為20小時(shí)，EB染色和成像進(jìn)行25分鐘，時(shí)間一共約話費(fèi)28小時(shí)。相關(guān)研究人員在進(jìn)行研究的時(shí)候一定要注意，快速分型法雖然比較簡(jiǎn)便，耗費(fèi)的時(shí)間也比較短，但是對(duì)于操作者的技術(shù)要求和熟練度要求都比較高，所耗費(fèi)的試劑成本也比較高，所以要在開始之前考慮清楚[5]。

4 多位點(diǎn)基因序列分析

多位點(diǎn)基因序列分析法是一種具有高分辨能力的分子生物學(xué)方式，可以通過序列不同的變化來反映不同菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，在進(jìn)行分子進(jìn)化學(xué)研究中發(fā)揮著重要的意義。在研究腸球菌的過程中，主要研究?jī)?nèi)容包括糞腸球菌和屎腸球菌，通過多位點(diǎn)基因序列分析法，可以在本地的實(shí)踐結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫以及大型數(shù)據(jù)庫的國際網(wǎng)站進(jìn)行查詢或比較，具有一定的便捷性。糞腸球菌和屎腸球菌的主要序列組成包括7個(gè)管家基因，主要為gdh，gyd，psts,gki，aroe，xpt,yiql[6]，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)以及腸球菌的分型來為其提供相應(yīng)的方式，這樣多位點(diǎn)基因序列分析數(shù)據(jù)庫就能夠?yàn)槿虻牧餍胁⊙芯刻峁┫鄳?yīng)的數(shù)據(jù)，對(duì)于在全世界范圍內(nèi)傳播的多重耐藥的腸球菌克隆株進(jìn)行識(shí)別和跟蹤。

5 焦磷酸測(cè)序法在腸球菌耐藥機(jī)制分析

在細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究中，許多案例需要驗(yàn)證已知dna片段的序列，而這種分析可以通過測(cè)量幾十個(gè)bp來滿足，雙脫氧核苷酸法和化學(xué)法可能不是最合適的方法。焦磷酸測(cè)序技術(shù)是1987年發(fā)展起來的一種新型酶連鎖串聯(lián)測(cè)序技術(shù)。焦磷酸測(cè)序法適用于已知短序列的測(cè)序。此外，它具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)，不需要凝膠電泳，不需要對(duì)dna樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，并且具有較高的并行性和自動(dòng)化程度。目前，它在細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究中還沒有得到廣泛的應(yīng)用，但有一定的發(fā)展空間。

腸球菌，尤其是屎腸球菌，通常具有多重耐藥性，由它們引起的嚴(yán)重感染的治療可能存在問題。利奈唑胺是一種新型惡唑烷酮類抗生素，能與細(xì)菌23srrnaa結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，對(duì)葡萄球菌和腸球菌均有高度耐藥性。利奈唑胺很罕見，但在使用利奈唑胺治療過程中可能發(fā)生，這與影響23srna肽基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域的染色體突變有關(guān)。利奈唑胺抗性是由多個(gè)等位基因編碼的23個(gè)srna中的g2576t單核苷酸多態(tài)性(snp)介導(dǎo)的。采用焦磷酸測(cè)序法快速檢測(cè)snps，檢測(cè)并評(píng)價(jià)含有t2576突變的23srns數(shù)量。

6 結(jié)語

本文所涉及到的這些分子生物學(xué)方式主要針對(duì)的是腸球菌耐藥性所提出的，但是這些方式也可以為其他細(xì)菌的耐藥性研究提供相應(yīng)的借鑒和思路。主要對(duì)飛行時(shí)間質(zhì)譜和聚合酶鏈反應(yīng)、Southren雜交技術(shù)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳、多位點(diǎn)基因序列分析四種方式進(jìn)行了分析，四種方式都具有一定的作用和意義，在進(jìn)行腸球菌耐藥性研究方面均提供了相應(yīng)的借鑒。但是我們?cè)谘芯康倪^程當(dāng)中需要注意，每一種方法都有一定的局限性，也有一定的作用，所以如何發(fā)揮不同方式的優(yōu)勢(shì)，取長補(bǔ)短，是我們研究的主要目的和意義，也值得繼續(xù)進(jìn)行探索。