赤松混交林枯梢病不同病級(jí)針葉內(nèi)部細(xì)菌多樣性研究

謝 憲，梁 軍,＊，朱彥鵬，時(shí) 良，高 燕，張 銘，程 元，張星耀,

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站，山東 煙臺(tái) 264100；3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012)

松枯梢病是世界范圍內(nèi)針葉樹(shù)上最常見(jiàn)和分布最廣的重要病害之一?？萆也〔≡鸀樗汕驓ゆ呔⊿phaeropsis sapinea(Fr.) Dyko & B. Sutton.），病菌侵染主要從寄主傷口處侵入，1997 年Stanosz 對(duì)Pinus resinosaLoisel.和北美短葉松（Pinus banksianaLambert.）的研究中首次發(fā)現(xiàn)無(wú)病斑的嫩梢上存在潛伏侵染[1]。劉艷在多個(gè)松屬樹(shù)種套袋隔離的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)冬季表面無(wú)病斑的梢上存在松枯梢病菌定殖的情況，來(lái)年可造成春梢發(fā)病[2]。松枯梢病已在我國(guó)10 余個(gè)省份的松林中發(fā)生，對(duì)松樹(shù)人工林造成了嚴(yán)重的危害，損失巨大，已列入我國(guó)重要的森林病害進(jìn)行研究。

植物內(nèi)生細(xì)菌在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官內(nèi)部，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系。隨著對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、生物控制和緩解脅迫等方面的深入研究[3]，寄主植物內(nèi)生細(xì)菌與病害的研究也越來(lái)越受到關(guān)注。內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)多種機(jī)制共同作用從而減輕或防止有害致病微生物對(duì)寄主的影響[4]，機(jī)制包括抗生（代謝物質(zhì)生產(chǎn)）、生長(zhǎng)促進(jìn)、誘導(dǎo)宿主防御（誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性）、寄生、競(jìng)爭(zhēng)和信號(hào)干擾（群體感應(yīng)）[5]。內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)生物固氮、加速消化、增磷和產(chǎn)生植物激素直接作用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而產(chǎn)生對(duì)生物因子的抗性[6]。松枯梢病作為真菌病害，在其拮抗細(xì)菌方面已有相關(guān)研究，如通過(guò)對(duì)健康及染病針葉的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌[7]，但關(guān)于枯梢病菌對(duì)松樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響方面未見(jiàn)相關(guān)研究。

昆崳山是赤松（Pinus densifloraSieb. et Zucc.）的原生地和天然分布中心，與黑松（Pinus thunbergiiParl.）、麻櫟（Quercus acutissimaCarruth.）等共組成地帶性天然次生林植被。為探究混交林中枯梢病對(duì)寄主內(nèi)生細(xì)菌的影響，選取典型混交林型針闊混交林（赤松-麻櫟）和針葉混交林（赤松-黑松），測(cè)定兩種混交林中赤松針葉內(nèi)生細(xì)菌的變化，探明不同枯梢病發(fā)病狀態(tài)下赤松針葉的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)，分析內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異，為松枯梢病的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣地設(shè)置

昆崳山（121°41′34″～121°48′04″ N，37°11′50″～37°17′49″ E）地處山東半島東部，屬暖溫帶季風(fēng)氣候，林區(qū)土壤屬森林棕壤，以沙質(zhì)壤土為主。昆崳山是我國(guó)和東北亞赤松原生地和天然分布中心，赤松在該區(qū)域與黑松、麻櫟等共同組成地帶性天然次生林植被。

共選取6 塊30 m × 30 m 樣地，其中3 塊樣地林分結(jié)構(gòu)為針闊混交林，由赤松以及麻櫟構(gòu)成，其中赤松占比52%～59%，海拔為210 ± 70 m，地理坐標(biāo)為121°43′35.0″ E，37°17′30.9″ N；121°45′08.4″ E，37°17′37.8″ N；121°43′19″ E，37°17′30.2″ N。另3 塊為針葉混交林，由赤松以及黑松構(gòu)成，其中赤松占比46%～49%，海拔為360 ± 30 m，地理坐標(biāo)為121°45′32.60″ E，37°16′3.06″ N；121°45′33.16″ E，37°15′57.94″ N；121°45′37.55″ E，37°15′52.17″ N。樣地立地條件均為中坡位，坡度為23° ± 3°，坡向?yàn)闁|南半陽(yáng)坡。

1.2 樣品采集

于2018 年9 月在3 塊針闊混交林樣地內(nèi)分別采集ZK1（全株無(wú)病斑赤松的針葉）、ZK2（染病赤松上無(wú)病斑針葉）、ZK3（染病較輕針葉，病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以下）、ZK4（染病較重針葉，病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以上）；在3 塊針葉混交林樣地內(nèi)分別采樣CZ1（全株無(wú)病斑赤松的針葉）、CZ2（染病赤松上無(wú)病斑針葉）、CZ3（病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以下）、CZ4（病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以上）。采用五點(diǎn)取樣法（在樣地內(nèi)四角及對(duì)角線中心處選樹(shù)，每個(gè)樣點(diǎn)選取一株染病赤松和一株全株無(wú)病斑赤松）采集樣本，針葉取自赤松上冠層，每個(gè)樣點(diǎn)各采集二年生針葉8 束，各類(lèi)針葉分別采集針葉40束，并進(jìn)行表面消毒處理。無(wú)菌水沖洗并晾干后，用75% 乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3 次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min 后，再用無(wú)菌水沖洗3 次，將最后一次沖洗后的無(wú)菌水稀釋至LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，3 d 后觀察結(jié)果，針葉外表無(wú)細(xì)菌殘留，證實(shí)針葉表面已滅菌。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌多樣性測(cè)定

使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)針葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性進(jìn)行測(cè)定。首先利用CTAB 法對(duì)樣本DNA 進(jìn)行抽提，完成后將DNA 樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop 檢測(cè)質(zhì)量合格后，取30 ng 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[8]。PCR 擴(kuò)增體系：DNA 樣品，1.0 μL；Forward Primer（5.0 μmol·L-1），1.0 μL；Reverse Primer（5.0 μmol·L-1），1.0 μL；BSA（2.0 ng·μL-1），3.0 μL；2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL；ddH2O，6.5 μL。進(jìn)行16S V3-V4 區(qū)基因擴(kuò)增，16S V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物序列為（5′-GTACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′）和（5′-GTGGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）。

PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，將PCR 產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Illumina Miseq PE300 平臺(tái)，并構(gòu)建Miseq 文庫(kù)以及Miseq上機(jī)測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

OTU（operational taxonomic units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，為某一個(gè)分類(lèi)單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。用uclust（Version 1.2.22）按照97%相似性將全部序列聚類(lèi)，去除singleton 的OTU，同時(shí)去除注釋為葉綠體、線粒體的序列，并得到代表序列和OTU 表。用usearch 按照97% 相似性序列進(jìn)行OTU 聚類(lèi)，得到代表序列再將其全部序列按照97% 相似度比對(duì)到OTU 上形成OTU 列表，使用Mothur 軟件計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1 和多樣性指數(shù)Shannon[9]。使用R 軟件（v2.15.3）繪制主成分分析圖。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳NCBI，編號(hào)為SUB 5584140。

2 結(jié)果與分析

2.1 操作分類(lèi)單元（OTU）及其多樣性分析

測(cè)序結(jié)果顯示，在針闊混交林ZK 的12 個(gè)樣品中共獲得細(xì)菌有效序列388 587 條，共計(jì)679 個(gè)OTU；在針葉混交林CZ 的12 個(gè)樣品共獲得細(xì)菌有效序列336 600 條，共計(jì)656 個(gè)OTU。各樣品Coverage 測(cè)序深度指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均接近于99%，且圖1稀釋曲線趨勢(shì)平緩，說(shuō)明各樣本中的細(xì)菌物種信息被充分檢測(cè)，結(jié)果能夠代表各類(lèi)針葉中細(xì)菌的真實(shí)水平。

根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌OTU 數(shù)目，對(duì)樣品中OTU 組成進(jìn)行分析，構(gòu)建Venn 圖（圖2）和群落結(jié)構(gòu)柱狀圖（圖3，4，5）。根據(jù)圖2a，在針闊混交林ZK 中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 83個(gè)，占OTU 總數(shù)的12.22%，4 類(lèi)針葉中特有的OTU 數(shù)目分別為90、69、59、25 個(gè)，以ZK1 中特有OTU 數(shù)目最多。根據(jù)圖2b，在針葉混交林CZ中不同染病程度的針葉中共有相同的OTU 69 個(gè)，占OTU 總數(shù)的10.51%，4 類(lèi)針葉中特有的OTU數(shù)目分別為120、79、66、45 個(gè)，同樣以CZ1 中特有OTU 數(shù)目最多。

表1 不同染病情況的赤松針葉內(nèi)細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)Table1 Abundance and diversity of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora

圖1 針葉內(nèi)部細(xì)菌OTU 稀釋曲線圖（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 1 OTU-based rarefaction curves of bacteria in needles of P. densiflora (a: coniferous and broad-l eaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

樣本內(nèi)細(xì)菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1，針闊混交林與針葉混交林中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及豐度呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。無(wú)病斑赤松針葉內(nèi)生細(xì)菌的Chao1 和Shannon 指數(shù)最高，即測(cè)得OTU 數(shù)與種類(lèi)數(shù)均最高，其次分別為染病赤松上的無(wú)病斑針葉、病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以下的赤松針葉、病斑長(zhǎng)度為針葉長(zhǎng)度二分之一以上的赤松針葉，隨著病菌侵染的加重，內(nèi)生細(xì)菌豐富度及多樣性呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

圖2 不同染病情況下赤松針葉內(nèi)細(xì)菌操作單元（OTU）分類(lèi)Venn 圖（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 2 Venn diagram of OTU distribution of endosphere bacteria in different level of disease in the needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

圖3 不同病害侵染狀態(tài)下赤松針葉內(nèi)部細(xì)菌門(mén)水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 3 Bacterial phyla from endosphere bacteria of different level of disease in the needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

2.2 細(xì)菌門(mén)水平的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群組成分析

圖4 不同病害侵染狀態(tài)下赤松針葉內(nèi)部細(xì)菌綱水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 4 Bacterial classes from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

圖5 不同病害侵染狀態(tài)下赤松針葉內(nèi)部細(xì)菌屬水平組成（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 5 Bacterial genera from endosphere bacteria of different level of disease in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

在針闊混交林中，對(duì)679 個(gè)OTU 進(jìn)行門(mén)、綱和屬水平上的歸類(lèi)，分屬28 個(gè)門(mén)、69 個(gè)綱、205 個(gè)屬。在門(mén)水平上（圖3a），變形菌門(mén)（Proteobacteria）占比最高，分別在4 類(lèi)樣品中占比55.39%、62.89%、38.53%、71.42%，變形菌門(mén)為針葉內(nèi)生細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌群，且在樣本中的相對(duì)豐度存在差異。ZK1 中相對(duì)豐度較高的門(mén)還有放線菌門(mén)（Actinobacteria）（11.42%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）（8.09%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）（5.78%）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）（4.61%）。ZK2 中相對(duì)豐度較高的門(mén)同ZK1 一致，占比略有差異，放線菌門(mén)（9.85%）、酸桿菌門(mén)（7.84%）、擬桿菌門(mén)（4.07%）、芽單胞菌門(mén)（3.68%）。ZK3 中相對(duì)豐度較高的門(mén)還有厚壁菌門(mén)（Firmicutes）（32.60%）、酸桿菌門(mén)（6.72%）、放線菌門(mén)（10.98%）。ZK4 中相對(duì)豐度較高的門(mén)還有酸桿菌門(mén)（14.61%）、浮霉?fàn)罹T(mén)（Planctomycetes）（4.41%）、放線菌門(mén)（2.89%）。

在針葉混交林中，對(duì)656 個(gè)OTU 進(jìn)行門(mén)、綱和屬水平上的歸類(lèi)，分屬29 個(gè)門(mén)、65 個(gè)綱、190個(gè)屬。在門(mén)水平上（圖3b），變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，分別為54.45%、56.24%、63.48%、74.83%。CZ1 中的相對(duì)豐度較高的門(mén)還有酸桿菌門(mén)（9.03%）、擬桿菌門(mén)（8.63%）、厚壁菌門(mén)（7.43%）、放線菌門(mén)（6.11%）。CZ2 中種類(lèi)構(gòu)成與CZ1 相近，其中厚壁菌門(mén)（15.69%）相對(duì)豐度上升，酸桿菌門(mén)（6.51%）與擬桿菌門(mén)（4.58%）相對(duì)豐度降低，放線菌門(mén)（6.31%）相對(duì)穩(wěn)定。CZ3 中的相對(duì)豐度較高的門(mén)還有厚壁菌門(mén)（11.09%）、酸桿菌門(mén)（12.08%）、放線菌門(mén)（1.46%）。CZ4 中相對(duì)豐度較高的門(mén)還有酸桿菌門(mén)（11.09%）、浮霉?fàn)罹T(mén)（4.18%）、放線菌門(mén)（2.86%）。

兩種混交林中，無(wú)病斑針葉的內(nèi)生細(xì)菌門(mén)水平結(jié)構(gòu)一致，變形菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)門(mén)，且其他相對(duì)豐度較高的菌門(mén)近似，包括放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)。隨著枯梢病的發(fā)生，在病斑較短的針葉中，均發(fā)生顯著的變化，兩種林分在該狀態(tài)下的內(nèi)生細(xì)菌差異最大，主要差異由于針闊混交林中厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度的升高。在病斑較長(zhǎng)的針葉內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)一致，均由變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、浮霉?fàn)罹T(mén)和放線菌門(mén)構(gòu)成，相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。

2.3 細(xì)菌綱水平的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群組成分析

在針闊混交林中，內(nèi)生細(xì)菌綱水平構(gòu)成見(jiàn)圖4a，無(wú)病斑及染病針葉內(nèi)生細(xì)菌均以α-變形菌（Alphaproteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌種，分別為34.26%、42.30%、28.53% 和63.68%。在ZK1 中，β-變形菌綱（Betaproteobacteria）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的占比分別為10.05%和7.06%，ZK2 中β-變形菌綱和γ-變形菌綱的占比分別為12.06% 和5.20%。ZK3 中特有芽孢桿菌綱Bacilli，占比為28.18%。ZK4 中，α-變形菌占比增高，且酸桿菌綱（Acidobacteria）（14.07%）和浮霉菌綱（Planctomycetacia）（4.41%）占比高于其他樣品（均低于1%）。

針葉混交林中，在內(nèi)生細(xì)菌綱水平上（圖4b），4 類(lèi)樣品中α-變形菌相對(duì)豐度均為最高，相對(duì)豐度分別為31.21%、39.51%%、52.66%和58.10%，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)。β-變形菌綱相對(duì)豐度分別為12.55%、10.36%、6.11% 和4.98%，γ-變形菌綱相對(duì)豐度分別為5.64%、3.39%、2.92%和1.73%，兩個(gè)綱的相對(duì)豐度均逐漸下降。芽孢桿菌綱（Bacilli）在CZ1、CZ2 和CZ3 中占比較高，3.32%、14.81%、7.10%，而CZ4 中低于1%。CZ4 中的δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria ）（10.03% ）、 酸 桿 菌 綱（10.56%）和浮霉菌綱（4.12%）占比較高。

兩種林分中，無(wú)病斑針葉內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)綱為α-變形菌綱。在染病初期，內(nèi)生細(xì)菌的豐度差異主要來(lái)自于芽孢桿菌綱的豐度變化。在針闊混交林中，芽孢桿菌綱在病斑較短的針葉中占比顯著高于其他樣本。在病斑較長(zhǎng)的針葉中，α-變形菌綱、酸桿菌綱和浮霉菌綱在兩種林分中組成優(yōu)勢(shì)菌群。

2.4 細(xì)菌屬水平的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群組成分析

在針闊混交林中，屬水平上（圖5a），unidenified 的屬占了較高的比例（42.40%、43.43%、32.89%、49.26%），在ZK1中，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas的相對(duì)豐度均較高，4 個(gè)屬的占比分別達(dá)到了4.51%、3.20%、3.20%、1.68%。ZK2 中，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas同樣占據(jù)了較高的比例（4.46%、5.73%、5.04%、2.28%），與ZK1 的優(yōu)勢(shì)菌屬一致。ZK3 中，乳桿菌屬（Lactobacillus）、Kroppenstedtia、Bryocella、魏斯氏菌（Weissella）相對(duì)豐度較高（16.5%、8.09%、5.47%、2.36%），其中乳桿菌屬占比最高，Massilia、Endobacter和Sphingomonas相對(duì)豐度降低。在ZK4 中Bryocella、Endobacter、Singulisphaera和Sphingomonas相 對(duì) 豐 度 較 高（13.82%、13.13%、4.39%、2.76%）。

針葉混交林中（圖5b），unidenified 的屬同樣占了較高的比例（36.59%、36.92%、38.38%、51.66%）。CZ1 中Bryocella（5.11%）、Massilia（4.52%）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）（4.32%）、Clostridium_sensu_stricto_1（3.59%）、Endobacter（2.99%）、薄層菌屬（Hymenobacter）（2.86%）和Sphingomonas（2.39%）占比較高，CZ2 中乳桿菌屬（6.97%）、Endobacter（4.91%）、Bryocella（4.78%）和Kroppenstedtia（4.12%）占比較高，與CZ1 的優(yōu)勢(shì)菌存在差異。CZ3 中，Bryocella（7.84% ）、Endobacter（7.44% ）、 乳 桿 菌 屬（4.52%）、Sphingomonas（2.72%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）（2.66% ） 和Granulicella（2.19%）占比較高，其中Granulicella明顯高于其他樣品。CZ4 中，相對(duì)豐度較高的菌有Bryocella（8.50%）、Endobacter（8.37%）、甲基桿菌屬（8.10%）、Singulisphaera（3.98%）、Sphingomonas（3.45%）和Methylocella（2.72%），其中甲基桿菌屬與Singulisphaera在其他樣品中相對(duì)豐度低于1.00%。

兩種林分中，無(wú)病斑針葉共有的優(yōu)勢(shì)屬有Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas，其它優(yōu)勢(shì)屬硝化螺旋菌屬、Clostridium_sensu_stricto_1相對(duì)豐度有差異，但并不顯著?？萆也∏秩竞?，在病斑較短的針葉內(nèi)細(xì)菌的屬中，Lactobacillus相對(duì)豐度的差異最大。在病斑較長(zhǎng)的針葉中，Bryocella、Endobacter、Singulisphaera、Sphingomonas在兩種林分中均為優(yōu)勢(shì)屬。

2.5 細(xì)菌Beta 多樣性分析

基于細(xì)菌綱水平的主成分分析，分析針闊混交林ZK 赤松針葉細(xì)菌的差異性（圖6a），結(jié)果表明，主成分PC1 與主成分PC2 的貢獻(xiàn)率分別為63.6%和26.4%，發(fā)病較重的針葉內(nèi)生細(xì)菌與其余3 類(lèi)相聚較遠(yuǎn)，表明在枯梢病侵染較嚴(yán)重的情況下，內(nèi)生細(xì)菌多樣性的變化較大，而無(wú)病斑針葉以及染病程度較輕的距離較近。染病較輕的狀態(tài)下與無(wú)病斑狀態(tài)相比，針葉內(nèi)生細(xì)菌的構(gòu)成差異較小。針葉混交林CZ 主成分分析（圖6b），主成分PC1與PC2 的貢獻(xiàn)率分別為71.17%和13.5%，其聚類(lèi)規(guī)律與針闊混交林ZK 一致。

圖6 赤松針葉內(nèi)部細(xì)菌主成分分析（a：針闊混交林；b：針葉混交林）Fig. 6 Principal component analysis of endosphere bacteria in needles of P. densiflora(a: coniferous and broad-leaved mixed forest; b: coniferous mixed forest)

3 討論

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)針闊混交林與針葉混交林的赤松針葉內(nèi)細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：針闊混交林的針葉中細(xì)菌有效序列388 587 條，共計(jì)679 個(gè)OTU，分屬28 個(gè)門(mén)、69 個(gè)綱、205 個(gè)屬；在針葉混交林針葉中的細(xì)菌有效序列336 600 條，共計(jì)656 個(gè)OTU，分屬29 個(gè)門(mén)、65 個(gè)綱、190 個(gè)屬。赤松針葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富，無(wú)病斑針葉與染病針葉的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門(mén)，無(wú)病斑針葉中內(nèi)生細(xì)菌菌屬為Massilia、Endobacter、Bryocella、Sphingomonas。在其他松屬類(lèi)的內(nèi)生細(xì)菌的研究中，經(jīng)分離純化獲得的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌株與本研究結(jié)論一致[10]。

研究結(jié)果表明，隨著病害侵染的加重，內(nèi)生細(xì)菌多樣性及豐度逐漸降低，與植原體對(duì)寄主根部?jī)?nèi)生細(xì)菌研究中得出的結(jié)論一致[11]，病原菌的入侵不僅對(duì)寄主植物組織造成危害，還對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。申紅妙[12]探明了桉樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌群落變化與桉樹(shù)對(duì)青枯病抗性間的關(guān)系，結(jié)果表明桉樹(shù)根部組織中內(nèi)生細(xì)菌的豐度減低，但莖、葉中內(nèi)生細(xì)菌的豐度未受影響，不同組織受病害的影響存在差異，該結(jié)論為不同部位的內(nèi)生微生物與病害的相關(guān)研究中得出的不同結(jié)果提供理論支持。植物內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的定殖是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，可以通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)植物體產(chǎn)生作用，而病原菌的入侵對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的定殖及傳播產(chǎn)生影響。

林分對(duì)土壤微生物的影響差異顯著[13-14]，在林分與內(nèi)生細(xì)菌的研究中，兩種林分混交林的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)相近，僅在部分優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)存在差異，推測(cè)的原因是內(nèi)生細(xì)菌多樣性更多地受到寄主的影響，不同于土壤微生物。無(wú)病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結(jié)構(gòu)等方面均存在差異，而兩種林分在枯梢病對(duì)針葉內(nèi)生細(xì)菌的影響差異方面呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。綱水平上，兩種林分中的優(yōu)勢(shì)綱均為α-變形菌，并隨病害的嚴(yán)重程度的加劇呈上升趨勢(shì)。屬水平上，無(wú)病斑針葉中的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)及相對(duì)豐度差別不大，Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas在兩種林分中均為優(yōu)勢(shì)屬。在枯梢病菌侵染后的針葉內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度受到影響，乳桿菌、Bryocella、Endobacter、 甲 基 桿 菌 屬M(fèi)ethylobacterium、Singulisphaera相 對(duì) 豐 度 升 高，Massilia和Sphingomonas占比下降。Massilia作為植物體內(nèi)生菌，能夠以甘油或葡萄糖為前體高效合成聚羥基丁酸酯[15]。Endobacter常在紫花苜蓿中分離得到[16]，Bryocella作為好氧化異養(yǎng)型細(xì)菌[17-18]，本研究中侵染較重的針葉中，Bryocella相對(duì)豐度升高，也說(shuō)明了該屬菌的生存未受病原菌的抑制。Sphingomonas在植物研究中發(fā)現(xiàn)具有一定的固氮作用，常在根際作為固氮細(xì)菌[19]，受病害影響呈相對(duì)豐度降低，其變化趨勢(shì)與其他病害對(duì)寄主的影響一致[20]。而染病針葉中Bryocella、Singulisphaera與乳桿菌屬相對(duì)豐度上升。Singulisphaera常見(jiàn)于土壤等腐殖質(zhì)中，而本研究中，其在病害較重的針葉中出現(xiàn)，可推測(cè)在較重針葉內(nèi)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)已被嚴(yán)重破壞，腐生性細(xì)菌入侵[21]。乳桿菌屬的部分種具有促生和提高發(fā)酵質(zhì)量的功效[22]，也曾從植物組織內(nèi)分離獲得[23]。此外，在針葉混交林中甲基桿菌屬上升。隨著病害的加重，甲基桿菌屬相對(duì)豐度升高，這與茶白星病侵染時(shí)豐度的表現(xiàn)一致[24]，但有研究表明甲基桿菌屬對(duì)部分病原微生物具有抑制性[25]，因此其對(duì)枯梢病病原菌是否具有抑制作用仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在針闊混交林與針葉混交林中，赤松針葉內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及豐度隨枯梢病侵染的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，兩種林分的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受枯梢病菌影響變化趨于一致。針闊混交林和針葉混交林中，無(wú)病斑針葉的相對(duì)豐度較高的內(nèi)生細(xì)菌菌屬均為Massilia、Endobacter、Bryocella與Sphingomonas?？萆也【那秩居绊懥藘?nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，細(xì)菌多樣性及相對(duì)豐度隨枯梢病的加重而降低。