板栗葉焦枯病相關(guān)病菌分離及病因初探

任 菲，董 煒，史勝青，汪慧華，竇桂銘，嚴(yán)東輝＊

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研宄院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)重點實驗室，北京 100091；2. 國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油加工研究所，北京 100037；3. 中國電力科學(xué)研究院，北京 100192；4. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；5. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 100085)

焦枯病是近年來樹木或植物常見的一類葉部病害。其病因復(fù)雜，多由不適環(huán)境因素引起，如營養(yǎng)元素過量和鉀元素缺乏、干旱脅迫、高溫日曬等，造成植物水分生理失調(diào)，導(dǎo)致葉組織大面積產(chǎn)生枯斑，引發(fā)葉焦枯[1-2]。隨著氣候變暖和環(huán)境變化，病原菌導(dǎo)致植物葉焦枯病的種類增多，如由侵染性病原菌真菌擬莖點霉Phomopsis mollissim與其共生菌板栗蛇孢日規(guī)殼Ophiognomonia castaneae引起的板栗褐緣葉枯病[3-4]；通過昆蟲媒介傳播的植物病原細(xì)菌木質(zhì)部難養(yǎng)菌Xylella fastidiosa導(dǎo)致的葉焦枯病也日益頻發(fā)。該細(xì)菌病原菌營養(yǎng)需求復(fù)雜、寄主范圍很廣，在多種重要的林木、觀賞性植物及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物形成嚴(yán)重危害，已經(jīng)成為全球性日益關(guān)注的新發(fā)流行病害[5-6]。

中國板栗（Castanea mollissimaBl.) 屬于殼斗科栗屬的植物，原產(chǎn)于中國，有“干果之王”之稱[7-8]，河北板栗主要產(chǎn)于河北省北部的燕山山區(qū)，以顆粒飽滿、香甜、皮薄、適于糖炒等特點著稱于世，久負(fù)盛譽(yù)，是河北省出口農(nóng)副產(chǎn)品中具有較大優(yōu)勢的土特產(chǎn)品之一，其產(chǎn)量、出口量和質(zhì)量，均居全國第一位[8-9]。并且，板栗栽種面積占到全省有林地的10%，成為河北省重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)樹種[10]。近些年，青龍、遷西等板栗主產(chǎn)地相繼發(fā)生一種新的葉部病害，板栗發(fā)病后，葉片上產(chǎn)生黃褐色的斑點，多個黃褐斑可滲透連片，以致使整個葉片上呈不規(guī)則的大面積焦枯狀，引起果實重量減少，產(chǎn)量下降，造成栗農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失，該病害發(fā)病原因亟待明確，盡早進(jìn)行有效的防控。

1 研究材料和方法

1.1 標(biāo)本采集及病征觀察

標(biāo)本于2019 年7 月至9 月，采于河北青龍縣和遷西縣(40.40° N, 118.95° E)5 個病害發(fā)生嚴(yán)重的板栗果園，果園相距5～70 km。在栗園，觀察癥狀的同時，放大鏡鏡檢病癥；在實驗室，解剖鏡鏡檢病組織表面病癥，及顯微鏡鏡檢病組織真菌分生孢子器和子實體或細(xì)菌霧；實驗室新鮮離體病葉組織濕培25℃，每天觀察病癥至第7 天。

1.2 病原菌分離

病原菌的分離和純化采用組織分離法[11]，將新鮮的病葉用清水沖洗干凈，用75% 乙醇表面消毒，從其病健交界處用滅菌手術(shù)刀切取3～5 mm,置于PDA 培養(yǎng)基、MEA 培養(yǎng)基和細(xì)菌蛋白胨培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲或菌落長出后，進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，并在PDA 培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿后，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每戶葉片組織接種12 個平板，每個PDA 平板接3 塊組織。

1.3 分離純化菌株的分子鑒定

分離菌株按形態(tài)初步歸類后，用CTAB 法提取和純化菌株的基因組DNA[12]，用通用引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行ITS rDNA 基因片段的擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，由北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測序。所得序列經(jīng)NCBI 進(jìn)行堿基Blast 同源性分析，確定菌株分類地位。利用Mega X 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法最大簡約法（Maximum parsimony，MP），可靠性檢驗bootstrap法，初始值1 000 次，外群為Acervus globulosusHKAS 88987，系統(tǒng)發(fā)育樹中本研究測得的序列號為MT373425-MT373459，Genbank 中下載用于比對分析做系統(tǒng)發(fā)育樹的序列見表1。

表1 Genbank 中下載用于比對分析做系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列Table 1 Sequences from Genbank for alignment and phylogenetic tree

1.4 潛在病原菌離體葉片及板栗盆栽苗接種

依據(jù)1.3 的結(jié)果，結(jié)合已報道致病性的菌株進(jìn)行接種試驗。室內(nèi)離體接種選取健康無病的新鮮葉片，葉片采自溫室1 年健康苗的成熟葉片（停止伸展發(fā)育后20～30 天），用清水沖洗干凈，75% 乙醇消毒5 min，再用無菌水沖洗多次，置于事先滅菌的培養(yǎng)皿（直徑150 mm，底部墊2～3 層無菌濾紙，并加入適量無菌水保濕）中。因為發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)觀察期間，分離菌株培養(yǎng)有產(chǎn)孢和不產(chǎn)孢，因此，接種體前者用分生孢子，后者用菌絲（菌餅）。將PDA 平板上培養(yǎng)5～7 天的分離物，無菌水沖洗孢子，制成106孢子·mL-1接種液；或用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣取菌餅。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)無傷接種不成功，因此，用刺傷進(jìn)行接種（用消毒昆蟲針在健康葉片表面針刺后，將菌餅貼接于刺傷部位）。每處理接種5 個葉片，每片葉接3 個點，另以葉片相同部位接種無菌水處理為對照。接種封好后置于25℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。接種48 h 后移去菌絲塊，隔天觀察發(fā)病情況并記錄兩周。

根據(jù)離體葉片接種結(jié)果，選取病原菌進(jìn)行1 年生盆栽苗接種實驗，將菌絲塊接種盆栽苗板栗葉片上，每種致病菌株接種3 盆苗木，每苗木處理5 個葉片，并用無菌水同時接種等數(shù)量的盆栽板栗苗作為對照，保鮮袋保濕24～48 h 后去掉，定期觀察發(fā)病情況。發(fā)病后取具有癥狀的組織再次進(jìn)行病原菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗園病害癥狀

病害在河北板栗園6 月開始發(fā)病，病樹整樹葉片均出現(xiàn)癥狀，發(fā)病樹木相對集中（圖1a），果園樹病率10%～50%，單株病葉率可至100%。該病害主要癥狀是，初始在葉片銳齒尖現(xiàn)褐色小點壞死（圖1b），隨著時間，順沿葉緣至兩側(cè)脈之間的葉間組織呈現(xiàn)黃褐色至黑褐色病斑，病斑形狀不規(guī)則，邊緣不整齊，大小為2～3 cm，每葉片上能產(chǎn)生多個病斑（圖1c），多個黃褐斑可滲透連片，以致使整個葉片上呈不規(guī)則的大面積焦枯狀，均出現(xiàn)在葉脈間的葉組織上，病斑病健部有不規(guī)則寬度的亮黃色邊緣線（圖1d）。但病害不造成早期落葉。林間病葉未見病癥。室內(nèi)顯微鏡觀察，也未見顯著真菌分生孢子器和子實體。室內(nèi)病組織保濕培養(yǎng)3 天后，可鏡檢到鏈隔孢屬Alternaria的分生孢子。栗園發(fā)病癥狀如圖1。

2.2 病葉菌株分離純化鑒定

栗園及室內(nèi)在新鮮癥狀組織上均沒有觀察或鏡檢到病癥，濕培3 天后的病組織表面上可見有分散的較暗的細(xì)點，鏡檢確認(rèn)是鏈隔孢屬Alternaria的產(chǎn)孢梗及其分生孢子，極易被從病組織表面抹去。顯微鏡鏡檢也沒有發(fā)現(xiàn)病健交界組織中的細(xì)菌菌溢現(xiàn)象。

圖1 河北板栗葉片焦枯病癥狀Fig. 1 leaf scorch ofCastanea mollissima in Hebei

表2 河北板栗焦枯葉真菌菌株分離結(jié)果Table 2 Fungi isolation from leaf scorch samples

病葉組織分離純化共獲得有效菌株102 株，均為真菌。在菌落形態(tài)聚類的基礎(chǔ)上，選取菌株擴(kuò)增ITS。結(jié)果這些真菌歸屬于10 科，12 屬，15種，豐度最高為Alternaria alternata（表2）。分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。分離菌株的主要培養(yǎng)物形態(tài)見圖3。

圖2 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育MP 樹Fig. 2 Phylogenetic tree (MP) of Isolation

2.3 潛在病原菌離體葉片及板栗盆栽苗接種實驗

依據(jù)文獻(xiàn)報道，重點挑選分離菌株中潛在的致病菌進(jìn)行板栗離體葉片接種實驗。選出8 個菌：半殼霉屬Leptostromasp.，蛇孢日規(guī)殼Ophiognomoniasetacea(Pers.) Sogonov， 梨 盾 殼 霉Coniothyrium pyrinum(Sacc.) J. Sheld.， 稻 黑 孢 菌Nigrospora oryzae(Berk. & Broome) Petch， 擬 莖 點 霉屬Phomopsissp. ， 膠 孢 炭 疽 菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz.) Penz. & Sacc.，Gnomoniopsis smithogilvyiL.A. Shuttlew., E.C.Y. Liew & D.I.Guest，交鏈鏈格孢Alternaria alternata(Fr.) Keissl.。只有其中O. setacea和C. pyrinum兩種菌接種的實驗葉片出現(xiàn)了病斑，4～5 天出現(xiàn)癥狀，一周后病斑基本穩(wěn)定，不再變化，病斑位置局限于接種點附近（圖4）。記號筆標(biāo)出了接種部位，而其他幾組菌種實驗連續(xù)觀察后均未出現(xiàn)明顯病斑癥狀。另外我們還嘗試混合了8 種菌絲液，并混合Ophiognomonia setacea和Phomopsissp.菌絲液進(jìn)行板栗離體葉片接種實驗，但并未出現(xiàn)明顯癥狀。

圖3 主要菌株培養(yǎng)物Fig. 3 Culture of main isolates

圖4 板栗離體葉片接種實驗癥狀Fig. 4 Symtoms of inoculation of isolated leaves indoor of Castanea mollissima

在O. setacea和C. pyrinum離體葉片致病的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了兩種菌株的1 年生板栗盆栽苗致病實驗。結(jié)果O. setacea和C. pyrinum兩種菌均引起盆栽苗成熟葉片的病變，出現(xiàn)褐色壞死病斑。病斑接種后一周左右出現(xiàn)，大小不定，形狀不規(guī)則，10～14 天后病斑停止擴(kuò)展趨于穩(wěn)定（圖5）。從發(fā)病部位可再次分離到這兩種病原菌。

圖5 板栗盆栽苗接種實驗癥狀Fig. 5 Symtoms of inoculation of Potted seedlings of Castanea mollissima

3 討論

3.1 板栗焦枯病病因分析

河北地區(qū)發(fā)生的栗葉焦枯病害主要癥狀是，初始葉緣刺突現(xiàn)褐色小點壞死，隨后，順沿葉緣至兩側(cè)脈之間的葉間組織呈現(xiàn)黃褐色至黑褐色不規(guī)則病斑，可擴(kuò)展連片，呈不規(guī)則的大面積焦枯，葉脈附近組織無癥狀，病健部有不規(guī)則寬度的亮黃色邊緣線。病樹在栗園可集中成片發(fā)生，病樹之間受害程度較為一致，單株病樹的病葉之間及栗園病樹間癥狀不呈現(xiàn)點狀擴(kuò)散分布趨勢特征，病樹發(fā)病葉片幾乎遍布整株，病葉之間癥狀極為一致。同一栗園同一樹木可連年發(fā)病，程度年間呈現(xiàn)變化。不同立地或地塊栗園和不同栗樹間均可發(fā)病，程度上可有差異。初步比較觀察，病樹的根部與健康樹的根部沒有明顯病變和異常氣味；病葉枝條（2～3 年生）橫切面觀察，未見到維管束褐變。我國板栗病害，姜淑霞等[13]曾報道了山東地區(qū)板栗褐緣葉枯病，稱病害突出特點為病斑壞死組織擴(kuò)散十分快，整葉出現(xiàn)焦枯，葉片脫落嚴(yán)重。葉片脫落后正面產(chǎn)生少量散生子實體，顯微鏡下分生孢子器散生，病原菌為Phomopsis mollissimae。另外報道有板栗黑（圓）斑病，病斑近圓形，有黃色暈圈，其病原為Cylindrosporium castanicola[14-15]；病菌Phomopsis castanea亦引起的葉斑病，表現(xiàn)為葉片大面積干枯[16]，但該病癥狀只有文字描述，沒有栗園和病樹圖像記錄。以上癥狀描述與本病害均存在不一致性，并且具有病癥，而本病害在栗園、室內(nèi)濕培以及鏡檢均未見到病癥以及特定真菌結(jié)構(gòu)。雖然通過組織分離法，分離到很多真菌，但室內(nèi)離體葉片實驗和板栗盆栽苗接種實驗，只有菌株O. setacea和C. pyrinum，能在成熟葉片上引起局限性的褐變病變，但均與林間焦枯病癥狀不一致。細(xì)菌Xylella fastidiosa.在歐美報道能引起嚴(yán)重的多種寄主葉焦枯病[5]，但未見到在栗屬植物上的為害報道。該病具有依賴?yán)ハx傳播的特點，病斑具有侵染點且具有明顯的病斑發(fā)生發(fā)展特征，這與我們觀察到的板栗葉焦枯病病斑發(fā)病特點明顯不同，板栗葉焦枯病發(fā)病初期和期間，病斑一出現(xiàn)即為較大面積的壞死病斑，病斑沒有侵染起始點、沒有從侵染點發(fā)展至病健部的病斑發(fā)生發(fā)展過程特征。難以培養(yǎng)的病原細(xì)菌，通常需要昆蟲媒介的傳播，但本病未觀察到刺吸式昆蟲的伴隨或為害。病組織常規(guī)鏡檢未觀察到菌溢現(xiàn)象。因此，本病的生物致病侵染屬性還有待進(jìn)一步的探究。

然而，隨著氣候變暖和環(huán)境污染增加，樹木葉焦枯病癥狀類病害頻現(xiàn)，這類病害更多的是環(huán)境中不利于植物生長發(fā)育的物理和化學(xué)等非生物因素引起的非侵染性焦枯病[17]。肥、水、土壤、氣候及耕作制度等環(huán)境條件與該病發(fā)生關(guān)系十分密切，其中尤以干旱、高溫日灼、營養(yǎng)不足為主導(dǎo)因素。SO2是我國主要大氣污染物之一，其危害從植物氣孔周圍細(xì)胞開始，初期斑點與氣孔形狀相似，后期針葉全葉枯死，闊葉發(fā)展為淡褐色或灰白色壞死斑，葉果早落[17]。而臭氧主要侵染葉片柵欄組織，葉面出現(xiàn)白色或褐色斑點，對針葉樹，癥狀多出現(xiàn)在成熟葉，對闊葉樹，癥狀首先出現(xiàn)在抽生枝條的近頂端葉片[17]。曹淑云[1]發(fā)現(xiàn)當(dāng)板栗葉片硼過量（含量超過400 mg·kg-1）時即發(fā)生焦枯癥狀；當(dāng)板栗葉片缺鉀（含量低于4 000 mg·kg-1）時即表現(xiàn)焦枯癥狀。但在本研究調(diào)查過程中，針對焦枯病，栗農(nóng)嘗試過包括微量元素全肥在內(nèi)的多種增加相關(guān)肥料的措施，對改善癥狀減輕程度表述不一。近些年為追求板栗產(chǎn)量，栗農(nóng)采用了大肥大水的管理措施，尤其是為便利收果，在栗園頻繁使用農(nóng)藥和除草劑。這些不合理的栗園管理措施，可能是板栗葉焦枯病發(fā)生的主要誘因。另外，葉焦枯病的發(fā)生可能與板栗品種有關(guān)，發(fā)病品種主要為燕山早豐3113品種。該品種由河北省昌黎果樹研究所于1973年，在楊家峪1.7 萬株板栗實生樹中選出推廣，其板栗優(yōu)質(zhì)性狀改善了板栗品種的局面，對產(chǎn)區(qū)的板栗增產(chǎn)起到了重要作用，在河北地區(qū)廣泛種植[18]。近些年，在全球氣候變化的大環(huán)境下和進(jìn)一步提升板栗產(chǎn)值的農(nóng)事管理活動中，品種頻現(xiàn)一些適應(yīng)性和抗病性問題。因此，綜合現(xiàn)場調(diào)查和研究結(jié)果，我們認(rèn)為河北近年大面積發(fā)生的板栗葉焦枯病的病因，需要擴(kuò)展考慮非侵染因素誘導(dǎo)的問題。該病亟待綜合病原菌、土壤水分利用、農(nóng)藥、復(fù)合肥、除草劑、氣候條件、管理措施等所有相關(guān)因素的綜合考察和研究探明病因，為及早防控病害帶來的經(jīng)濟(jì)損失提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 分離菌株致病性

本研究新發(fā)現(xiàn)并驗證了O.setacea和C. pyrinum兩種病原菌可在中國板栗葉片上致病。O.setacea與板栗蛇孢日規(guī)殼O.castaneae同屬，后者為山東地區(qū)板栗褐緣葉枯病原菌板栗擬莖點霉Phomopsis castaneae-mollissimae協(xié)同致病菌[19]。除O.castaneae外，該屬僅有O.apiospora和O.asiatica在我國赤楊和櫟屬上報道過有分布[19-20]。O.setacea主要在歐美國家報道，與該屬其他成員相比寄主范圍相對更廣泛一些[21-22]，在中國板栗上未有過報道。在實驗室本菌PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)7 天的菌落特征為近圓形，直徑約5 cm，邊沿起伏，淺黃綠粉質(zhì)，具環(huán)狀同心輪紋，培養(yǎng)觀察期間未見產(chǎn)孢（圖6a）。分子鑒定中，菌株ITS rDNA 序列與O. setacea模式種的序列相似性97%，我們將其暫定為此種。

圖6 Ophiognomonia setacea 和Coniothyrium pyrinum 培養(yǎng)物Fig. 6 Culture of Ophiognomonia setacea and Coniothyrium pyrinum.

C. pyrinum主要在蘋果葉片形成葉斑，葉斑大小形狀顏色各異，斑點嚴(yán)重的葉片變黃早落，一般發(fā)生在仲夏雨季[23]。其還可以引起杏樹嚴(yán)重的枯死和潰瘍病[24]。該菌在板栗上可以引起病害為首次發(fā)現(xiàn)。病菌培養(yǎng)性狀如圖6b。PDA 上7 天的菌落近圓形，直徑約4.5 cm，邊緣光滑，菌落棕黃色，產(chǎn)有淺黃色素滲入培養(yǎng)基并彌散于整個培養(yǎng)基中，培養(yǎng)期間未觀察到子實體形成。該菌ITS 序列與C.pyrinum模式菌株高度同源，覆蓋率100%下，相似性達(dá)99%。

另外我們分離到的其他一些未表現(xiàn)致病性的菌株，在栗屬（CastaneaMill.）其他植物上有相應(yīng)致病性報道。如分離到的兩株Gnomoniopsis smithogilvyi被報道能在歐洲板栗（Castanea sativaMill.）上引起嚴(yán)重的潰瘍癥[25]及果腐病[26-27]。在全球氣候變化等因素影響下，病原菌寄主范圍擴(kuò)大現(xiàn)象日益普遍，此類病原菌存在成為板栗新發(fā)病害的可能性，應(yīng)予以重視。

4 結(jié)論

初步研究結(jié)果表明，青龍和遷西板栗果園嚴(yán)重發(fā)生的葉焦枯病中，未能明確為上述相關(guān)病原菌所引起。其病因有待進(jìn)一步的綜合、深入和細(xì)致地開展研究，尤其需要考慮與為追求產(chǎn)量，高投入的不合理水、肥和農(nóng)藥使用等栗園管理措施以及環(huán)境因素和品種適應(yīng)性等相關(guān)性的可能。研究中，發(fā)現(xiàn)并驗證的O. setacea和C. pyrinum兩種病原菌可在中國板栗上致病，為板栗可能出現(xiàn)的新病害的發(fā)生和認(rèn)識提供了基礎(chǔ)。