紫外-可見分光光度計(jì)的改造及其在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

陳玉清，陳雙雯，姬媛媛

1廈門大學(xué)化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，福建 廈門361005

2廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門361005

紫外-可見分光光度計(jì)是基于紫外-可見分光光度法原理，利用物質(zhì)分子對(duì)紫外-可見光譜區(qū)的輻射吸收來進(jìn)行分析的一種分析儀器，主要由光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和信號(hào)處理器等部件組成。1918年，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制成了第一臺(tái)紫外-可見分光光度計(jì)。此后，紫外-可見分光光度計(jì)經(jīng)不斷改進(jìn)，又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、微機(jī)控制等各種類型的儀器，使分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度也不斷提高，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。紫外-可見分光光度計(jì)在環(huán)保、農(nóng)產(chǎn)品和食品分析、植物生化分析、飼料分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。近年來，紫外分光光度計(jì)的研究報(bào)道依然不少，但主要集中在產(chǎn)品的應(yīng)用與方法研究[2-14]及檢定維護(hù)[15-19]等相關(guān)方面，使用者對(duì)于儀器應(yīng)用功能的研究報(bào)道極為少見，尤其是儀器改造方面。筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有紫外分光光度計(jì)進(jìn)行了簡(jiǎn)易的改造，拓展了儀器的使用功能，同時(shí)，將其與恒流泵和部分收集器聯(lián)用，組建新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)，并在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加以應(yīng)用，提高儀器的使用效率。

1 儀器改造的初衷

筆者所在化學(xué)生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室屬于專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，主要承擔(dān)化學(xué)生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。這兩門實(shí)驗(yàn)課程主要面向化學(xué)生物學(xué)專業(yè)(必修)和學(xué)院內(nèi)其他專業(yè)(選修)。蛋白質(zhì)的分離純化(含鹽析、柱層析等)是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)是蛋白質(zhì)柱層析的主要設(shè)備，該系統(tǒng)主要包括部分收集器、核酸蛋白檢測(cè)儀、恒流泵和記錄儀，而相關(guān)設(shè)備在其他實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中鮮有使用。筆者在多年的實(shí)驗(yàn)室管理中發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)的核酸蛋白檢測(cè)儀和記錄儀經(jīng)常會(huì)因?yàn)槭褂妙l率較低等原因?qū)е聦?shí)驗(yàn)課中儀器穩(wěn)定性下降，甚至出現(xiàn)較多的故障。為了解決相關(guān)困擾，筆者多年來一直不斷探索相關(guān)儀器的可替代設(shè)備，并最終將目標(biāo)鎖定在分光光度計(jì)上。

2 可行性分析

實(shí)現(xiàn)分光光度計(jì)替代核酸蛋白檢測(cè)儀和記錄儀主要面臨兩個(gè)方面的問題：1) 流動(dòng)進(jìn)樣；2) 數(shù)據(jù)的連續(xù)采集與記錄。筆者實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有多種分光光度計(jì)(詳見表1)，經(jīng)過綜合分析，筆者選用島津UV-1750作為首選對(duì)象。

表1 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有分光光度計(jì)統(tǒng)計(jì)情況

2.1 硬件可行性分析

分光光度計(jì)是教學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見的分析儀器，其數(shù)據(jù)采集的靈敏度和精度等能夠完全滿足蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)的需要。實(shí)驗(yàn)室分光光度計(jì)樣品室單元通常通過內(nèi)置比色皿支架與普通比色皿配合使用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣品的分析與測(cè)試，不能滿足流動(dòng)樣品的在線檢測(cè)功能，而流動(dòng)樣品的在線檢測(cè)是蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)的必要條件。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上的微量石英流動(dòng)比色皿可以很好地解決上述問題。

2.2 軟件的可行性分析

島津UV-1750可以使用專用的PC軟件UV Probe，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、處理、打印，可顯示光譜數(shù)據(jù)以及時(shí)間過程曲線。通過對(duì)軟件的分析，軟件中動(dòng)力學(xué)的時(shí)間掃描程序可以實(shí)現(xiàn)樣品數(shù)據(jù)的連續(xù)采集與記錄，進(jìn)而問題轉(zhuǎn)化為相關(guān)參數(shù)的設(shè)定能否滿足實(shí)驗(yàn)的需要。經(jīng)過對(duì)采集參數(shù)的進(jìn)一步整理與分析(詳見表2)，序號(hào)9以前的參數(shù)可以滿足普通實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要，序號(hào)12以前的參數(shù)可以滿足多數(shù)科研實(shí)驗(yàn)的需要。

表2 采集參數(shù)分析

3 紫外-可見分光光度計(jì)的改造與應(yīng)用

3.1 儀器的改造與BSA的檢測(cè)

島津UV-1750的改造針對(duì)樣品室單元進(jìn)行，如圖1A所示，采用流動(dòng)比色皿置于比色皿支架上，流動(dòng)比色皿上端端口分別連接硅膠管，從樣品室底部小孔經(jīng)儀器底部從左側(cè)或前方出來，一端連接樣品，另一端連接收集裝置。改造后的島津UV-1750可替代核酸蛋白檢測(cè)儀和記錄儀應(yīng)用于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)，組建成新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)，如圖1B所示。

3.2 BSA的初步檢測(cè)

新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)用于牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)初步分析，實(shí)驗(yàn)分析條件：層析柱內(nèi)徑16 mm、高400 mm，填料為Sephadex G-100，洗脫液為磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)，BSA 濃度 4 mg·mL?1，上樣量 1 mL，流速 0.72 mL?min?1，采集周期 0.7 s，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，改造后的UV-1750能夠很好地應(yīng)用于BSA的檢測(cè)。

圖2 BSA的初步分析

3.3 蛋清的分析及新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

蛋清的處理：取新鮮雞蛋(4 °C預(yù)冷)一個(gè)，分離蛋清(后續(xù)步驟都在4 °C下進(jìn)行)，用PBS稀釋5倍，靜置30 min，離心3220 g (10 min)，收集上清備用。

實(shí)驗(yàn)分析條件如3.2節(jié)(采樣周期調(diào)整為0.8 s)，上樣分析兩次，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，蛋清中蛋白檢測(cè)情況良好且得到了一定的分離；兩次上樣分析的結(jié)果幾乎完全重疊，表明實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。復(fù)雜生物樣品蛋清的分析同時(shí)也明確了新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)可以替代傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)，應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中。

圖3 蛋清的分析

2019年上半年實(shí)驗(yàn)室開設(shè)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“凝膠過濾層析純化堿性磷酸酶”(堿性磷酸酶為學(xué)生從牡蠣中提取的樣品)的教學(xué)中，部分小組使用了新蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)，并取得了預(yù)期滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)語

島津UV-1750的改造，拓展了儀器的使用功能，提高儀器的使用效率，該改造同樣適用于島津UV-1780等系列的相關(guān)產(chǎn)品。改造后的設(shè)備特別適用于實(shí)驗(yàn)室樣品分離純化過程中的在線分析或監(jiān)測(cè)(分光光度法)，同時(shí)不影響樣品的制備。該改造方法易于操作，理論上適用于實(shí)驗(yàn)室常用的大部分分光光度計(jì)，易于推廣；分光光度計(jì)增加流動(dòng)比色皿都很容易，且多數(shù)設(shè)備具有數(shù)據(jù)輸出接口，不同設(shè)備改造的區(qū)別主要在數(shù)據(jù)采集軟件方面，即使沒有相關(guān)軟件或現(xiàn)有軟件無法滿足要求，通過編程等信息化手段也不難實(shí)現(xiàn)。

儀器改造的初衷來源于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，并最終應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。改造后的島津UV-1750可應(yīng)用于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)部分收集系統(tǒng)中，解決了核酸蛋白檢測(cè)儀和記錄儀長(zhǎng)期在使用中產(chǎn)生的困擾，同時(shí)可以減少相關(guān)設(shè)備的購置，降低實(shí)驗(yàn)室設(shè)備采購的成本。