免疫傳感器芯片表面的抗體固定化方法*

李 靜, 崔傳金, 龔瑞昆, 王春皓, 邵 斌

(華北理工大學(xué) 電氣工程學(xué)院，河北 唐山 063210)

0 引 言

免疫傳感器作為一種新興的傳感器，將傳統(tǒng)的免疫測試和傳感器技術(shù)融為一體，集兩者的諸多優(yōu)點于一身，不僅減少了分析時間，而且提高了靈敏度和測試精度。免疫傳感器的檢測靈敏度取決于捕獲抗體如何固定在表面密度低的固體載體上，抗體作為免疫傳感器最主要的識別元件，選擇親和力好、穩(wěn)定性高的抗體不僅能使它們的抗原捕獲潛力最大化而且能夠提高傳感器的性能[1,2]。

抗體是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，能夠特異性結(jié)合相應(yīng)抗原的免疫球蛋白?？贵w由兩個抗原結(jié)合區(qū)域(Fab)和一個可結(jié)晶區(qū)域(Fc)組成。兩個Fab片段由鉸鏈區(qū)域的二硫鍵連接形成的F (ab’)2片段。鉸鏈區(qū)含有大量的脯氨酸，因此容易伸展和彎曲。Fab區(qū)域在氨基酸組成、等電點和物理結(jié)構(gòu)上都與抗體Fc區(qū)域不同，從而可以確定抗體在表面上的取向[3]。理想情況下，固定化抗體的Fc片段面向傳感器表面，然而隨機固定的抗體可能以各種方式散落在表面孔道，不僅造成部分抗體的失活，還會降低傳感器靈敏度。

在固體表面有效的固定抗體是包括免疫測定和生物傳感器在內(nèi)的各個領(lǐng)域的重要課題。然而，沒有一種抗體固定方法是普遍適用的，都需要將固相載體和抗體自身的性質(zhì)來結(jié)合起來進行選擇。

1 物理吸附

物理吸附是溶質(zhì)與吸附劑之間由于分子間力而產(chǎn)生的吸附，是最早抗體固定化方法。因其操作簡單，固定化酶活力較高而被廣泛應(yīng)用。但是由于物理吸附?jīng)]有選擇性，抗體并不固定在固體表面的特定位置上，酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過程中容易脫落，常與交聯(lián)劑使用。Zhang Z等人[4]采用直接吸附法構(gòu)建了用于鄰苯二酚檢測的免疫傳感器，在優(yōu)化的條件下，該傳感器的電化學(xué)響應(yīng)是線性的，鄰苯二酚的濃度范圍從0.5～300.0 mm。王存嫦等人[5]結(jié)合自組裝單分子膜(SAMs)和聚電介質(zhì)靜電吸附組裝技術(shù)，通過靜電吸附作用固定抗體，實現(xiàn)了對相應(yīng)抗原的檢測。

2 共價耦合

2.1 氨基、羧基耦合

化學(xué)偶聯(lián)方法可以減小抗體固定過程的隨機性并增強固定抗體的穩(wěn)定性。但是基于氨基(NH2)和羧基(COOH)的抗體固定隨機性較強，有時在Fab片段抗原結(jié)合區(qū)域附近會有反應(yīng)性較強的NH2或COOH，此時通過NH2或COOH的固定方式容易造成抗體的失活。

Alizadehzeinabad H等人[6]將抗體的COOH端與2—巰基乙胺SAM上的NH2端共價結(jié)合，實現(xiàn)抗體在金叉指電極上的定向固定。該免疫傳感器的線性范圍為5 pg/mL～1 ng/mL，檢出限為1.34 pg/mL，信噪比為3；Roxana J J等人[7]利用聚乙烯亞胺的NH2與大腸桿菌抗體的COOH進行偶聯(lián)，實現(xiàn)了抗體與芘—聚乙二醇修飾的金電極連接，構(gòu)建了檢測尿致病性大腸桿菌UTI89細菌的免疫傳感器，其線性檢測范圍為1 101～1 104 cfu/mL，檢出限為10 cfu/mL；Seenivasan R等人[8]利用共價鍵結(jié)合將抗體固定在氨化的金納米顆粒溶液修飾的氧化銦錫陣列電極表面，構(gòu)建了檢測癌細胞的免疫傳感器。該傳感器實現(xiàn)了快速準確檢測微量樣品中癌細胞的數(shù)目。檢測時間不超過6 min，檢測范圍25～300 cell/20 μL，檢測的重現(xiàn)性達97 %。

2.2 硫醇基

金硫醇鍵的開發(fā)使得這種固定化方法在表面等離子體共振(SPR)等技術(shù)中對金襯底和納米顆粒非常有用，根據(jù)光子固定化技術(shù)的方法，紫外線激發(fā)也被用于在抗體的鉸鏈區(qū)域啟動二硫鍵的光還原。利用258 nm和10 kHz的紫外脈沖，可以產(chǎn)生自由硫醇，然后可以結(jié)合金襯底進行石英晶體微平衡測量[9]。Korean J等人[10]將2—亞氨基硫代烷與蛋白質(zhì)的初級胺發(fā)生反應(yīng)，引入SH基團，同時保持與原始NH2類似的電荷性質(zhì)。通過硫代反應(yīng)，可以將包括抗體在內(nèi)的目標(biāo)生物分子直接有效地固定在金表面；Xu M等人[11]基于硫醇—金相互作用將硫代抗體固定在納米金表面?；诹虼贵w的免疫傳感器在大腸桿菌污染的河流和自來水樣品中檢出限為10 cfu/mL，檢測時間為1 h，獲得了更好的性能。

2.3 通過糖基部分的偶聯(lián)

利用抗體Fc部分的一個獨特的碳水化合物部分是另一種共價固定方法。Ho J A等人[12]利用硼酸與生物素抗體的碳水化合物單元相互作用，將抗體固定在硼酸修飾的絲網(wǎng)印刷石墨電極上，構(gòu)建了檢測生物素的免疫傳感器，該傳感器最大化地增加了表位密度，檢出限為0.19 pg；Liu Y S等人[13]利用共聚物刷(3D和靈活性)和硼酸的優(yōu)點，通過Fc端碳水化合物與環(huán)硼酸酯結(jié)合定向固定抗體，使抗體結(jié)合位點充分暴露，從而提高了抗體抗原的結(jié)合效率；Zhao J等人[14]將兩性離子磺甜菜與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)共聚物固定在惰性聚丙烯上，硼酸基團通過與活性GMA單元共價結(jié)合，對抗體進行定向固定。硼酸基團在聚合物刷中能夠促進抗體定向固定，所以抗體的生物活性得到很好的保存，使表面抗原結(jié)合能力顯著增強。

3 親和作用

3.1 生物素—親和素

生物素通常從卵黃和肝組織中提取。親和素可由蛋清提取，是一種由4個相同亞基組成的糖蛋白。使用較多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素，鏈霉親和素的4個生物素結(jié)合位點兩兩靠近，這使得鏈霉親和素可以作為橋連分子，將生物素化的抗體與固相連接起來[15]。利用生物素—親和素之間的親和作用，可以提高抗體抗原的結(jié)合能力，但是該方法需預(yù)先包被，對抗體生物素化。

Li Y等人[16]將大腸桿菌O157∶H7和霍亂弧菌的生物素化抗體連接到涂有鏈霉親和素的磁珠上，通過抗體抗原相互作用原理捕獲功能化檢測抗體，構(gòu)建了能同時測定大腸桿菌O157∶H7和霍亂弧菌的免疫傳感器，其檢出限分別為39 cfu/mL和32 cfu/mL；Sun X C等人[17]在金膜上對大腸桿菌O157∶H7進行免疫磁珠標(biāo)記免疫分析，采用雙抗體夾心免疫法和鏈霉親和素—生物素結(jié)合法將納米磁珠固定在二抗上，構(gòu)建了檢測大腸桿菌的免疫傳感器，其檢出限為100 cfu/mL；Ma X等人[18]將生物素標(biāo)記的抗體固定在牛血清白蛋白和親和素修飾的玻璃碳膜載體上，通過堿性磷酸酶標(biāo)記的糖基多糖—3(GCP3)與抗體結(jié)合，構(gòu)建了檢測GPC3的免疫傳感器，檢出限為0.2 ng/mL。

3.2 蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G法

蛋白A包含四個特定于抗體Fc區(qū)域的結(jié)合位點，可以與許多哺乳動物的免疫球蛋白Fc區(qū)域特異性結(jié)合，同時使Fab區(qū)域用于抗原結(jié)合。這種生物功能化方法可以實現(xiàn)抗體的定向固定化，使結(jié)合位點暴露于包含待檢測目標(biāo)分析物的樣本溶液中，從而最大限度地與它們進行相互作用，而且相對于隨機固定，固體載體上定向固定蛋白A增強了抗體結(jié)合能力[19]。Miyaoa H等人[20]將生物素羧基載體蛋白(BCCP)融合到蛋白A的IgG結(jié)合域，通過BCCP與生物素蛋白連接酶(BPL)的絡(luò)合作用，將融合蛋白固定在傳感器芯片的BPL修飾金表面，蛋白A與抗體的結(jié)合使抗體固定在IgG結(jié)合域?qū)?，且固定化的抗體具有較高的抗原結(jié)合能力；Shantai L B等人[21]將蛋白A共價固定在功能化的硅晶片表面，通過蛋白A識別抗體實現(xiàn)了布魯氏菌抗體的定向固定，構(gòu)建了檢測布魯氏菌的免疫傳感器，該傳感器檢測布魯氏菌的效率是隨機固定抗布魯氏菌抗體傳感器的3倍，檢出限為1×106cfu/mL。

蛋白G在許多免疫檢測中被廣泛用于固定不同類型的抗體，該蛋白能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc區(qū)域?qū)崿F(xiàn)抗體的定向固定，從而使抗原結(jié)合位點最佳地暴露于檢測溶液中。此外，蛋白G介導(dǎo)的抗體固定化通常不需要任何抗體修飾。Huo X H等人[22]在交聯(lián)劑EDC/NHS的作用下將蛋白G與復(fù)合材料的殼聚糖結(jié)合，加入一抗與蛋白質(zhì)G結(jié)合定向固定，甲胎蛋白(AFP)與一抗結(jié)合，標(biāo)記的二抗與AFP結(jié)合進行固定，構(gòu)建了檢測AFP的免疫傳感器，該傳感器線性范圍寬，檢出限為1.5 pg/mL；Centi S等人[23]利用EDC/NHS將蛋白質(zhì)G偶聯(lián)到聚乙二醇修飾的金屬納米棒表面，蛋白質(zhì)G和抗體結(jié)合實現(xiàn)抗體的定向固定。

3.3 DNA定向引導(dǎo)法

DNA定向蛋白固定化是一種通過序列特異性雜交在表面固定蛋白DNA偶聯(lián)物的有效方法，可以為固定化抗體提供有序的定向。該方法提高了抗原的結(jié)合能力，但需預(yù)先包被，將寡核苷酸鏈偶聯(lián)至抗體。

Hu W P等人[24]將雙鏈DNA(DsDNA)通過NH2與乙二醇(OEG)活化出的COOH共價偶聯(lián)固定在混合的OEG/COOH-OEG SAM上，然后用NaOH使固定的DsDNA去雜交，經(jīng)去離子水洗滌得到單鏈DNA，最后與抗體結(jié)合的互補單鏈雜交固定抗體；Kimura T等人[25]合成了一個溫度響應(yīng)表面，通過DNA雙鏈結(jié)構(gòu)固定抗體，選擇性捕獲和釋放靶細胞；Seymour E等人[26]利用DNA偶聯(lián)抗體，使用單粒子干涉反射成像傳感器快速靈敏地檢測整個病毒，特定的DNA序列通過共價鍵將每一個抗體進行編碼，抗體—DNA結(jié)合物通過序列特異性雜交固定在傳感器表面互補的單鏈DNA探針上，增強了對病毒病原體的檢測。

3.4 Fc結(jié)合肽和適配體

針對抗體Fc結(jié)構(gòu)域的短肽被用來促進定向固定。Tsai C W等人[27]證明分子動力學(xué)可用于設(shè)計短肽，對小鼠IgG 2a抗人前列腺特異性抗原(PSA)抗體具有較高的特異性，通過SPR監(jiān)測PSA結(jié)合，表明其具有良好的抗體定位。

Tang J B等人[28]利用免疫球蛋白G結(jié)合蛋白(ZZ蛋白)和聚苯乙烯結(jié)合肽(PS-tag)形成的的融合蛋白，并通過PS-tag與親水性聚苯乙烯的相互作用將ZZ蛋白固定在PS上，然后ZZ蛋與Fc片段相互作用實現(xiàn)抗體的定向固定。與被動固定化的ZZ蛋白相比，ZZ-PS標(biāo)記的靈敏度提高了10倍，線性范圍也更寬；Lee Y等人[29]開發(fā)了在大腸桿菌中表達的光活化Fc特異性抗體結(jié)合蛋白(FcBPs)，該蛋白在紫外線照射下與抗體發(fā)生光交聯(lián)。將FcBPs固定在馬來酰亞胺包覆的載玻片上，表皮生長因子受體(EGFR)-hmAb抗體與紫外線照射交聯(lián)。劑量依賴性抗原結(jié)合在110 fmol以上；Ma J等人[30]設(shè)計了一種DNA適配體，能夠結(jié)合多個小鼠子類的Fc結(jié)構(gòu)域。該領(lǐng)域具有開發(fā)通用Fc結(jié)合底物適配體的潛力，從而提高抗體定位和免疫診斷敏感性。

3.5 金屬親和層析

最簡單的方法是利用抗體的內(nèi)源性金屬結(jié)合特性。除了用于金屬配位的重組肽標(biāo)記外，還利用金屬親和純化了天然無標(biāo)記IgG。利用組氨酸和半胱氨酸與金屬，特別是銅和鋅的相互作用，利用固定化金屬親和層析技術(shù)對蛋白質(zhì)進行分離純化。

Chen H等人[31]利用PBA將NiO修飾的單壁納米管(NiO-SWNTs)堆積在金芯片上，通過NiO與組氨酸標(biāo)記物之間的螯合作用，定向地將組氨酸標(biāo)記的單克隆抗體固定在NiO-SWNTs上，構(gòu)建的免疫傳感器的檢出限為0.1 ng/mL；Welch N G等人[32]利用傳統(tǒng)的低污染二甘醇二甲醚等離子體聚合物(DGPP)作為結(jié)合[Cr(OH)6]3—的底物，然后進行抗體固定，將大量的抗體固定在DGPP和鉻功能化DGPP底物上，觀察到鉻功能化收縮期ELISA信號強度提高了10倍。Welch N G等人[33]也通過改變金屬鹽和緩沖基化合物以及比例來優(yōu)化絡(luò)合物，采用優(yōu)化的復(fù)合物(六水合高氯酸鉻對乙二胺的比例為1∶1)，相對于未處理平板，提高了牛腫瘤壞死因子ELISA 抗原檢測限一個數(shù)量級。

4 重組抗體的固定

重組抗體(rAb)具有低分子量、易于捕獲抗原等優(yōu)點，是天然重組抗體的潛在替代品。而針對完整抗體開發(fā)的基于Fc結(jié)構(gòu)域或碳水化合物部分定向固定化方法，并不能用于rAb或抗體片段，如單鏈抗體(scAb)或單鏈抗體可變區(qū)基因片段(scFv)。為了保證scFv或scAb在不變性的情況下更容易地固定在傳感器表面上，人們開發(fā)了多種方法來固定它們。抗體片段可以被設(shè)計成在肽連接物中含有帶正電荷的氨基酸(如精氨酸)，或者在羧基端有一個6—組氨酸氨基酸序列，分別通過靜電和非共價相互作用來固定。生物親和方法也可以將scFv固定在鏈霉親和素包被的表面上，方法是通過scFv上的游離胺與生物素結(jié)合的高特異性使得利用單一的rAb來檢測抗原成為可能，從而消除了對第二種抗原的特異性抗體的需要。由于rAb的體積小，免疫傳感器不能被激活，也不能在高密度的環(huán)境下工作，因此提高了測定的準確性、靈敏度和穩(wěn)定性[1]。

5 結(jié) 論

抗體的固定要在理想狀態(tài)下。首先，要保持抗體的自然狀態(tài)，不對抗體進行蛋白標(biāo)記；其次，固定抗體的基片要表面均勻一致、無毒、生物兼容性好、制備簡單和價格便宜；最后，抗體固定在芯片上要達到排列均勻，且固定點位方向一致，即要達到高密度的均勻一致的定向固定。隨著基因工程、免疫學(xué)和納米技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)新抗體或抗體Fc片段上能參加固定反應(yīng)的特異性強的新基團或位點，是進一步提高抗體定向固定的基礎(chǔ)，如具有單一抗原結(jié)合域的駱駝雙目抗體因其高溶解度和穩(wěn)定性而備受關(guān)注。其次，根據(jù)抗體結(jié)合點位的特點和性質(zhì)發(fā)現(xiàn)和選取合適的“固定底物”是抗體定向固定的又一個重要方面，如選取分子量更小的多肽和適配體，能提高抗體的固定密度。再次，表面均勻的新型納米材料基片可能會極大地促進“固定底物”的固定密度和牢固程度，間接提高抗體的固定密度，如金屬有機骨架等新型納米材料。最后，抗體的定向固定是個復(fù)雜的綜合過程，需要根據(jù)特定的抗體，進行技術(shù)方法的創(chuàng)新、獲取的完備固定工藝是抗體定向固定的關(guān)鍵。