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    miR-495-3p聯(lián)合黃氏總皂苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究

    2021-04-09 08:52:14劉亞東盧小偉
    安徽醫(yī)藥 2021年4期
    關(guān)鍵詞:總皂苷高糖成骨細(xì)胞

    劉亞東,盧小偉

    作者單位:湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨外科,湖北 十堰442000

    骨質(zhì)疏松癥是中老年人最常見的骨科疾病,隨著中國(guó)社會(huì)老齡化,骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐步上升,而骨折是最常見也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(Diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病的并發(fā)癥之一,以糖尿病為特征,伴隨著骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)改變、骨強(qiáng)度降低和骨脆性增加。DOP是一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥,2型糖尿病被認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥相關(guān)骨折的危險(xiǎn)因素。目前,DOP的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。既往研究表明,高糖環(huán)境下,成骨細(xì)胞的增殖受抑制,凋亡率明顯升高。黃芪總皂苷(Total saponins of Astragalus membranaceus,TSA)是黃芪主要的活性成分之一,現(xiàn)階段已分離得到包括黃芪皂苷Ⅰ-Ⅷ在內(nèi)的40多種三萜皂苷類成分。資料顯示,TSA可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞NSCs的增殖。由黃芪等藥材制成的黃芪散可以促進(jìn)高糖作用下的成骨細(xì)胞增殖。黃芪注射劑可以明顯提高22例DOP病人的骨密度,取得較好療效。然而,TSA 作用于DOP的研究鮮見報(bào)道。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的非編碼RNA。報(bào)道指出,微小RNA-495-3p(miR-495-3p)通過調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生過程中的多種表觀遺傳修飾因子起到腫瘤抑制劑的作用,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)處理顯著下調(diào)人牙周膜細(xì)胞這miR-495-3p 表達(dá),但miR-495-3p對(duì)成骨細(xì)胞的作用尚不明確。因此,2018年2月至2019年4月,本研究利用高糖誘導(dǎo)商購(gòu)小鼠的細(xì)胞MC3T3-E1構(gòu)建DOP模型,觀察黃芪總皂苷對(duì)高糖培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并結(jié)合miR-495-3p探尋其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

    小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心,黃芪總皂苷(純度≥98%)購(gòu)自源葉生物公司,DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,葡萄糖、噻唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司,RIPA 裂解液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司,miRNA 提取試劑盒購(gòu)自上海Qiagen公司,Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween,TBST)購(gòu)自上海生工生物工程公司,胰酶、凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleave-caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology 公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

    MC3T3-E1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2~3次,胰酶消化后進(jìn)行接種傳代。轉(zhuǎn)染時(shí),以1×10個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板,待其生長(zhǎng)至80%融合度時(shí),嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 試劑說明書進(jìn)行,將miR-495-3p、抗miR-495-3p(anti-miR-495-3p)及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    細(xì)胞用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為對(duì)照(NC)組(MC3T3-E1 細(xì)胞),高糖組(30 mmol/L 葡萄糖+MC3T3-E1細(xì)胞),高糖+不同濃度TSA 組(高糖+0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL TSA+MC3T3-E1 細(xì)胞),高糖+miRNA陰性對(duì)照(miR-con)組(高糖+轉(zhuǎn)染miR-con),高糖+miR-495-3p組(高糖+轉(zhuǎn)染miR-495-3p),高糖+TSA+抗miRNA陰性對(duì)照(anti-miR-con)組(高糖+2.0 μg/mL TSA+轉(zhuǎn)染anti-miR-con),高糖+TSA+anti-miR-495-3p(高糖+2.0 μg/mL TSA+轉(zhuǎn)染anti- miR-495-3p)。其中,TSA作用時(shí)間為48 h。

    1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

    收集各組MC3T3-E1細(xì)胞,加入胰酶消化,以1×10個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板,培養(yǎng)48 h,加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL,37 ℃孵育4 h,棄上清液,加入DMSO 200 μL,37 ℃搖床孵育10 min,于酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞490 nm 波長(zhǎng)處吸光度值(OD值),根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%

    1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

    胰酶消化各組MC3T3-E1細(xì)胞,以5×10個(gè)/mL,加入500 μL Annexin V緩沖液重懸細(xì)胞,隨后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管,在室溫黑暗條件下用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 孵育30min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    1.5 qRT

    -

    PCR 檢測(cè)miR

    -

    495

    -

    3p 的表達(dá)水平

    利用miRNA 提取試劑盒提取MC3T3-E1 細(xì)胞中總miRNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以制成的cDNA 為模板,U6 為參照,進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。miR-495-3p 正向引物序列為5'-TCAATAAATTTGGTGGTCCTCGG-3',反向引物序列為5'-TAGGCCTTGCACGAAGATGG-3'。反應(yīng)結(jié)束后,收集Ct值,以2法分析miR-495-3p相對(duì)表達(dá)量。

    1.6 Western blotting 檢

    測(cè)CyclinD1、Cleave

    -

    cas

    pase

    -

    3蛋白表達(dá)

    在各組細(xì)胞中加入RIPA裂解液,充分提取總蛋白,10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白,之后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,在5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜,TBST充分洗膜后與二抗(1∶5000稀釋)室溫孵育1h,加入TBST充分洗膜。置于化學(xué)發(fā)光液中顯色、顯影,以β-actin為參照,分析CyclinD1、Cleave-caspase-3相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3

    -

    E1(高糖)增殖的影響

    MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC細(xì)胞組比較,高糖組MC3T3-E1細(xì)胞存活率大幅減少(

    P

    <0.05)。與高糖細(xì)胞組比較,高糖與0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10 μg/mL 濃度TSA 組MC3T3-E1細(xì)胞存活率明顯升高,并呈劑量依賴性(

    P

    <0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇2.0 μg/mL的TSA濃度進(jìn)行相關(guān)研究。見表1。

    表1 不同濃度TSA抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)增殖/(%,±s)

    2.2 TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3

    -

    E1(高糖)凋亡的影響及qRT

    -

    PCR檢測(cè)miR

    -

    495

    -

    3p的表達(dá)水平

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于NC細(xì)胞組,高糖組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率顯著升高(

    P

    <0.05)。相比于高糖細(xì)胞組,高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯減少M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞凋亡率(

    P

    <0.05)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明,與NC細(xì)胞組比較,高糖顯著增加MC3T3-E1細(xì)胞Cleavecaspase-3表達(dá)量(

    P

    <0.05)。與高糖細(xì)胞組比較,高糖與2.0 μg/mL TSA組顯著降低MC3T3-E1細(xì)胞Cleavecaspase-3蛋白水平(

    P

    <0.05)。qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,與NC細(xì)胞組相比,高糖組MC3T3-E1細(xì)胞中miR-495-3p 表達(dá)量大幅減少(

    P

    <0.05)。與高糖細(xì)胞組相比,高糖與2.0 μg/mL TSA組明顯增加MC3T3-E1細(xì)胞中miR-495-3p表達(dá)量(

    P

    <0.05)。見表2,圖1,。

    表2 TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)凋亡的影響/±s

    圖1 TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)凋亡的影響:A為Western blotting檢測(cè)Cleave-caspase-3蛋白表達(dá);B為流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

    2.3 miR

    -

    495

    -

    3p 促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3

    -

    E1(高糖)增殖,抑制凋亡

    與NC 細(xì)胞組比較,高糖明顯降低MC3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達(dá)量,提高細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。與高糖+miR-con 組比較,過表達(dá)miR-495-3p 明顯提高高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 表達(dá)量,降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

    P

    <0.05)。見表3,圖2。

    2.4 低表達(dá)miR

    -

    495

    -

    3p 可以逆轉(zhuǎn)TSA 對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3

    -

    E1(高糖)增殖和凋亡的影響研究

    高糖與2.0 μg/mL TSA 組明顯提高M(jìn)C3T3-E1 細(xì)胞存活率、miR-495-3p、CyclinD1 水平,顯著降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3表達(dá)量(

    P

    <0.05)。與高糖+TSA+anti-miR-con 組相比,高糖、2.0 μg/mL TSA 和轉(zhuǎn)染antimiR-495-3p組顯著降低MC3T3-E1細(xì)胞存活率、miR-495-3p 和CyclinD1 表達(dá)量,明顯提高細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平(

    P

    <0.05)。見圖3,表4。

    3 討論

    本研究以高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷,這種模型構(gòu)建方式前人早有報(bào)道。吳娟等發(fā)現(xiàn)高糖高脂以時(shí)間依賴方式抑制成骨細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡并上調(diào)cleaved caspase-3 表達(dá)。顏曉芳等指出間歇性高糖明顯降低成骨細(xì)胞中CyclinD1 及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)水平。本研究中,高糖明顯減少M(fèi)C3T3-E1 細(xì)胞存活率和CyclinD1 表達(dá)量,增加細(xì)胞凋亡率和Cleavecaspase-3表達(dá)(

    P

    <0.05),這與上述研究一致。

    表3 miR-495-3p促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)增殖,抑制凋亡/±s

    表4 低表達(dá)miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)增殖和凋亡的影響研究/±s

    圖2 Western blotting檢測(cè)過表達(dá)miR-495-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)CyclinD1和Cleave-caspase-3的影響

    圖3 低表達(dá)miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1(高糖)增殖和凋亡的影響(Western blotting檢測(cè))

    黃芪總皂苷TSA 從藥用植物黃芪提取而來,是黃芪主要的活性成分,對(duì)各種類型的癌癥表現(xiàn)出抗腫瘤能力,還具有降血糖、抗炎、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等活性。黃芪可以改善血糖水平,在糖尿病及其并發(fā)癥治療中擁有廣泛的應(yīng)用前景。不同配比的黃芪總皂苷和姜黃素聯(lián)用對(duì)糖尿病模型大鼠具有良好的治療效果。以往的資料顯示,黃芪提取物或多糖對(duì)成骨細(xì)胞具有一定調(diào)節(jié)能力,可有效緩解大鼠卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。黃芪甲苷I刺激成骨細(xì)胞MC3T3-E1中β-連環(huán)蛋白和Runt家族相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá),通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路刺激成骨細(xì)胞分化。大鼠成骨細(xì)胞加入不同體積分?jǐn)?shù)的黃芪注射液分別培養(yǎng)3、5、7、9天,成骨細(xì)胞的增殖能力得到顯著促進(jìn),并呈現(xiàn)量效趨勢(shì)。黃芪甲苷IV 可作為促進(jìn)骨整合的生長(zhǎng)因子,激活Hedgehog信號(hào)通路并顯著促進(jìn)人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和遷移。然而TSA對(duì)高糖培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚未可知。本實(shí)驗(yàn)中,TSA 明顯增加高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞存活率和CyclinD1蛋白表達(dá)量,降低MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3水平,提示黃芪總皂苷可以改善高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷,促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,與前人對(duì)黃芪及其皂苷促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用相符。

    miRNA 是一種短鏈非編碼RNA,其通過引起靶mRNA 的降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。已有證據(jù)表明,miRNA參與高糖刺激的成骨細(xì)胞分化過 程,例 如miR-335-5p,miR-424,miR-449。研究發(fā)現(xiàn),miR-590-5p 過表達(dá)減弱高糖對(duì)MC3T3-E1生長(zhǎng)的抑制作用,顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。然而,miR-495-3p是否會(huì)影響高糖條件下MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)仍然知之甚少。本研究中,高糖刺激MC3T3-E1 細(xì)胞,導(dǎo)致miR-495-3p 表達(dá)量減少,這說明在高糖條件下,miR-495-3p可能在成骨細(xì)胞功能中起重要作用。過表達(dá)miR-495-3p顯著提高高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞存活率、CyclinD1表達(dá)量,降低細(xì)胞凋亡率和Cleave-caspase-3 水平,證明miR-495-3p促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,這與黃芪總皂苷的效果相似。在MC3T3-E1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-495-3p,進(jìn)一步考察TSA保護(hù)高糖損傷成骨細(xì)胞的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-495-3p可以逆轉(zhuǎn)TSA促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MC3T3-E1 增殖作用和抑制其凋亡作用,表明調(diào)控miR-495-3p可能是黃芪總皂苷發(fā)揮保護(hù)高糖損傷成骨細(xì)胞功能的重要機(jī)制之一。

    綜上所述,黃芪總皂苷可以改善高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷,抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡,其作用機(jī)制與調(diào)控miR-495-3p 表達(dá)有關(guān),這為理解糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ),也為黃芪的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了新思路。但是關(guān)于黃芪總皂苷保護(hù)高糖損傷成骨細(xì)胞的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。

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