溴苯基姜黃素對膽管癌細胞凋亡、遷移和侵襲的影響及機制研究

趙冀安 馬艷榮 聶文佳 董梁 劉文聰 谷敬鋒

摘 要 目的：研究溴苯基姜黃素（GL63）對人膽管癌RBE細胞凋亡、遷移和侵襲的影響，并基于Janus激酶（JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（STAT）信號通路探討其作用機制。方法：采用MTT法檢測不同濃度GL63[0（空白對照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L]作用48 h對RBE細胞增殖的影響，并計算其半數(shù)抑制濃度（IC50）;采用結晶紫染色法檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用48 h對細胞集落形成的影響;分別采用流式細胞術、Hoechst 33342染色法、細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h對細胞周期分布、凋亡情況以及細胞遷移和侵襲能力的影響;采用Western blotting法檢測不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）作用24 h對細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關蛋白表達的影響。結果：不同濃度GL63組（1.25～40 μmol/L）RBE細胞的增殖抑制率均較空白對照組顯著升高（P<0.01），并呈劑量依賴趨勢;其IC50為（8.46±1.30） μmol/L。與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）RBE細胞的集落形成抑制率均顯著降低（P<0.01）;G0/G1期細胞占比均顯著升高，S期細胞占比均顯著降低（P<0.01）;細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），且細胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)并可見凋亡小體;細胞遷移愈合率均顯著降低（P<0.01），穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P<0.01）;細胞中磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、前體胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、Pro-caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2相關x蛋白（Bax）、細胞色素C、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Cleaved-caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。結論：GL63能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來實現(xiàn)對人膽管癌RBE細胞增殖、遷移和侵襲的抑制并誘導其發(fā)生凋亡。

關鍵詞 溴苯基姜黃素;膽管癌;RBE細胞;Janus激酶2/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路;遷移;侵襲;凋亡

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of bromophenylcurcumin（GL63） on the apoptosis， migration and invasion of human cholangiocarcinoma RBE cells， and to investigate its mechanism based on JAK/STAT signaling pathway. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of different concentrations of GL63 [0（blank control， similarly hereinafter）， 1.25， 2.5， 5， 10， 20， 40 μmol/L] on the proliferation of RBE cells after 48 h treatment; the IC50 was calculated. The effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on colony formation were detected by crystal violet staining after 48 h treatment. Flow cytometry， Hoechst 33342 staining， cell scratch test and Transwell chamber invasion test were used to detect the effects of different concentrations of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on cell cycle distribution， apoptosis， migration and invasion ability after 24 h treatment. Western blotting assay was adopted to detect the effects of different concentration of GL63 （0， 5， 10， 20 μmol/L） on the expression of JAK2/STAT3 signal pathway associated proteins. RESULTS： The proliferation inhibition rates of RBE cells in different concentrations of GL63 groups （1.25-40 μmol/L） were significantly increased， compared with blank control group? （P<0.01）， and showed a dose-dependent trend， with IC50 of （8.46±1.30） μmol/L. Compared with blank control group， inhibition rates of RBE cell colony formation were significantly decreased in different concentrations （5， 10， 20? μmol/L） of GL63 groups （P<0.01）. The percentage of RBE cells at G0/G1 phase increased significantly， while that at S phase decreased significantly （P<0.01）. The apoptotic rate increased significantly （P<0.01）， and the nucleus showed dense pyknosis and apoptotic bodies. The rate of cell migration and healing was significantly decreased （P<0.01）， and the number of invasive cells through basement membrane was significantly decreased （P<0.01）. The protein expression of p-JAK2， p-STAT3， Bcl-2， MMP-2， MMP-9， Pro-caspase-9 and Pro-caspase-3 were down-regulated significantly while the expression of Bax， Cyt-c， Cleaved-caspase-9 and Cleaved-caspase-3 were up-regulated significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： GL63 may inhibit the proliferation，migration and invasion of RBE cells and promote its apoptosis by inhibiting JAK2/STAT3 signal pathway.

KEYWORDS? ?Bromophenylcurcumin; Cholangiocarcinoma; RBE cell; JAK2/STAT3 signal pathway; Migration; Invasion; Apoptosis

膽管癌是一種來源于膽管上皮細胞的高度侵襲性惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[1]。膽管癌的惡性程度高、發(fā)病隱匿、診治困難，雖然外科根治性切除術為目前臨床治療膽管癌的首選，但患者術后預后較差[2]，所以尋找抑制膽管癌細胞增殖、侵襲的有效藥物，是目前臨床亟待解決的主要問題。姜黃素是從姜科植物中提取的一種植物多酚類物質，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物學活性，但是臨床研究顯示由于其生理條件下的不穩(wěn)定性，使得該成分的生物活性和藥動學行為均不理想，從而造成其在抗癌治療方面的應用受限[3-4]。本研究選用了一種新的姜黃素衍生物——溴苯基姜黃素（GL63）為對象。與姜黃素相比，GL63的水溶性和穩(wěn)定性大為提高，并具有較高的細胞通透性，體現(xiàn)出較高的生物利用度和較強的藥理活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，Janus激酶（JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（STAT）信號通路與膽管癌的發(fā)生密切相關[6]。因此，本課題組通過體外研究觀察GL63作用于人膽管癌細胞后對細胞凋亡、遷移和侵襲行為的影響，同時通過JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關蛋白探索其可能機制，以期為膽管癌的治療提供新的思路與藥物選擇。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究涉及的主要儀器包括：NU-400-400E型超凈工作臺（美國ShelLab公司），F(xiàn)ORM 361型細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electronic公司），TGL16型高速離心機（長沙英泰儀器有限公司），TC20型細胞計數(shù)儀、xMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司），AE31型倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（德國Motic公司），CKX31型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），D2060R型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司），DYCZ-24DN型垂直電泳儀（北京市六一儀器廠），BOX XR型凝膠成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司），F(xiàn)A1004型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品和試劑

姜黃素原料藥（批號78246，純度99.5%）、RPMI? 1640培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司;GL63原料藥（純度>99.5%）由河北科技大學化學與制藥工程學院劉守信教授合成并鑒定;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人JAK2、磷酸化JAK2（p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關x蛋白（Bax）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、細胞色素C（Cyt-c）、前體胱天蛋白酶9（Pro-caspase-9）、裂解Caspase-9（Cleaved-caspase-9）、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號分別為ab39636、ab195055、ab137803、ab131103、ab59348、ab53154、ab97779、ab38898、ab90529、ab69541、ab2324、ab90437、ab49822、ab37168）和MTT試劑均購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號sc-2025）購自美國Santa Cruz公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;基質膠購自美國BD公司;細胞總蛋白質抽提試劑、蛋白定量試劑盒、結晶紫試液均購自北京索萊寶科技有限公司;ECL發(fā)光檢測試劑盒購自美國Millipore公司;Hoechst 33342藍色熒光染料購自美國BioVision公司;0.25%胰酶購自武漢尚恩生物技術有限公司;其余試劑為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

人膽管癌RBE細胞株來自中國科學院北京細胞生物研究所。

2 方法

2.1 GL63對RBE細胞增殖的影響考察

采用MTT法進行檢測。取RBE細胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）于5%CO2、37 ℃（以下培養(yǎng)條件相同）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)瓶底部貼壁細胞達90%以上時，用0.25%胰酶消化后進行傳代。將對數(shù)生長期細胞用培養(yǎng)基調整為1×105個/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含有不同濃度GL63[終濃度均為0（空白對照，下同）、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L;劑量根據文獻[3-5]及本課題組前期預試驗結果設置]的RPMI 1640培養(yǎng)基（含0.1%二甲基亞砜），每組設3個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)完畢后，用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的光密度（OD）值并計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率=（空白對照組OD值-給藥組OD值）/空白對照組OD值×100%;采用SPSS 13.0軟件根據藥物濃度和細胞增殖抑制率計算GL63的半數(shù)抑制濃度（IC50）。試驗重復3次。

2.2 GL63對RBE細胞集落形成的影響考察

采用結晶紫法進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，以500個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)待其貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L，劑量根據“2.1”項MTT法試驗和本課題組前期預試驗結果設置，下同）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，持續(xù)替換新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d使細胞形成集落。培養(yǎng)結束后，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）洗滌，并用4%多聚甲醛溶液固定20 min，再以1%結晶紫試液染色。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞增殖形成的集落，對其進行計數(shù)并計算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=給藥組集落均數(shù)/空白對照組集落均數(shù)×100%。試驗重復3次。

2.3 GL63對RBE細胞周期分布和凋亡的影響考察

采用流式細胞術對細胞周期分布和凋亡情況進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，以1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集、洗滌細胞。在細胞中先后加入Annexin Ⅴ-FITC、PI試劑各5 μL，混勻，于室溫下避光反應15 min后，用流式細胞儀進行細胞周期和細胞凋亡檢測。試驗重復3次。

另采用Hoechst 33342染色法對細胞凋亡情況進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1×105個/孔接種于6孔板中，蓋上蓋玻片培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基。將細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄上清液，用PBS清洗2次后，每孔加入固定液固定10 min;以PBS漂洗3次后，滴加Hoechst 33342藍色熒光染料100 μL，室溫放置10 min;用PBS清洗3次再晾干后，以340 nm波長的紫外光激發(fā)，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 GL63對RBE細胞遷移的影響考察

采用劃痕實驗進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待其融合至90%，采用尖端粗細相同的無菌槍頭垂直劃線;用PBS清洗除去懸浮的細胞后，將余下細胞分組并分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后，于倒置相差顯微鏡下觀察劃痕距離，每個樣品隨機選取5個視野，分別測量并計算初始劃痕時和加藥培養(yǎng)完畢后的劃痕距離的差值（即細胞遷移距離）并取平均值。計算細胞遷移愈合率：遷移愈合率=細胞遷移距離平均值/初始劃痕距離均值×100%。實驗重復3次。

2.5 GL63對RBE細胞侵襲的影響考察

采用Transwell小室侵襲實驗進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞以0.25%胰酶消化后，按1.5×105個/mL接種于Transwell小室上室（鋪有基質膠，加入菌液體積為0.5 mL），下室加入等體積完全培養(yǎng)基，然后上下室均分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，用棉簽擦去上室漂浮的細胞，再用4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，再浸入結晶紫試液中染色20 min，在倒置相差顯微鏡（100倍）下隨機選取5個視野進行拍照并對細胞進行計數(shù)，取平均值。實驗重復3次。

2.6 GL63對RBE細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法進行檢測。將對數(shù)生長期RBE細胞按照“2.3”項下方法消化、接種、培養(yǎng)，分別加入含不同濃度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)液，加入蛋白裂解液冰浴裂解25 min后，收集細胞裂解液，于4 ℃下以15 000 r/min離心30 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。上清液經蛋白上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃下變性5 min。取變性后的蛋白適量，進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉移至PVDF膜上;用5%脫脂牛奶封閉后，加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、Cyt-c、Pro-caspase-9、Cleaved-caspase-9、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3和GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫下孵育2 h;以TBST緩沖液洗膜經ECL化學發(fā)光試劑處理后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 5.0軟件分析相應目標蛋白條帶與內參GAPDH條帶的灰度值之比，用來表示目標蛋白的表達水平。試驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間數(shù)據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 GL63對RBE細胞增殖的影響

結果顯示，與空白對照組比較，經不同濃度GL63（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）作用48 h后，細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.01），分別為（6.58±1.21）%、（15.28±1.64）%、（33.66±1.92）%、（52.53±2.16）%、（76.25±2.63）%、（92.28±3.67）%，且這一抑制作用有隨著藥物濃度升高而逐漸升高的趨勢，詳見圖1。經計算，GL63對RBE細胞的IC50為（8.46±1.30） μmol/L。

3.2 GL63對RBE細胞集落形成的影響

結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞的集落密度均有所減少，其集落抑制率分別為（64.88±3.45）%、（34.70±2.57）%、（15.10±1.78）%，較空白對照組（100%）均顯著降低（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而逐漸降低的趨勢，詳見圖2。

3.3 GL63對RBE細胞周期的影響

結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）G0/G1期細胞占比均顯著升高，S期細胞占比均顯著降低（P<0.01），且均有隨著藥物濃度升高而升高/降低更明顯的趨勢，詳見圖3、表1。

3.4 GL63對RBE細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而升高的趨勢，詳見圖4、表1。

Hoechst 33342染色法結果顯示，空白對照組細胞核呈現(xiàn)彌散均勻的低強度藍色熒光，細胞核完整且染色均勻。不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）均可見致密濃染的凋亡細胞，表現(xiàn)為核染色質的固縮濃集、破裂、藍色熒光強度增大且不均勻的典型凋亡現(xiàn)象，并可見凋亡小體;其凋亡率均較空白對照組顯著升高（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而升高的趨勢，詳見圖5、表1。

3.5 GL63對RBE細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞的橫向遷移距離均有縮短，遷移愈合率顯著降低（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而降低的趨勢，詳見圖6、表2。Transwell小室侵襲實驗結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P<0.01），且有隨著藥物濃度升高而減少的趨勢，詳見圖7、表2。

3.6 GL63對RBE細胞中JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關蛋白表達的影響

結果顯示，與空白對照組比較，不同濃度GL63組（5、10、20 μmol/L）細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Pro-caspase-9、Pro-caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，Bax、Cyt-c、Cleaved-caspase-9、Cleaved- caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），且均有隨著藥物濃度升高而降低/升高的趨勢;JAK2、STAT3蛋白表達水平在各組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見圖8、圖9、表3、表4。

4 討論

據研究報道，姜黃素在體外可阻滯膽管細胞系的細胞周期，發(fā)揮細胞毒性作用，可抗細胞增殖并誘導其凋亡[7]。但由于其結構不穩(wěn)定使應用受限，因此有研究者通過刪除其結構中活性β-二酮部分，設計并合成了姜黃素的單羰基類似物GL63，即（1E，4E）-1，5-雙（2-溴苯基）戊-1，4-二烯-3-酮[8]。研究表明，GL63不僅在體外具有較強的穩(wěn)定性和抗腫瘤活性，而且在體內也表現(xiàn)出比姜黃素更理想的藥動學行為[9]。還有研究表明，GL63對人肝癌HepG2細胞和人鼻咽癌CNE2細胞的毒性作用是基于內質網應激途徑而誘導的細胞周期停滯;而且GL63和姜黃素均未誘導正常肝細胞凋亡，這表明GL63沒有明顯的毒性，與姜黃素類似[10-11]。本研究表明，GL63抑制人膽管癌RBE細胞增殖和集落形成的能力有隨著藥物濃度升高而增強的趨勢;GL63抑制RBE細胞增殖的IC50為（8.46±1.30） μmol/L，與姜黃素IC50（21.5 μmol/L）[4]相比明顯降低。這些結果表明，姜黃素衍生化合物GL63有望被開發(fā)為有效、安全的新型抗腫瘤藥物。

細胞周期停滯和形態(tài)變化是腫瘤細胞增殖受到抑制的主要特征[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，隨著GL63作用濃度的升高，RBE細胞在G0/G1期的占比顯著升高、S期占比顯著降低;細胞核染色質表現(xiàn)為固縮濃集、破裂、藍色熒光強度增強且不均勻的典型凋亡現(xiàn)象;細胞凋亡率也顯著升高。這也進一步證實了GL63可抑制RBE細胞的增殖。

JAK2/STAT3信號通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程緊密相關，其能促進腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡，可調節(jié)涉及各種生理功能的靶蛋白的表達，包括抗凋亡蛋白（Bcl?xl、Bcl?2）、促凋亡蛋白（Bax）和線粒體凋亡途徑相關蛋白（Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9）[13]。重要的是，激活的JAK2/STAT3信號通路已被廣泛驗證為治療人類腫瘤的新型分子靶標[14]。本研究基于JAK2/STAT3信號通路腫瘤相關蛋白考察了GL63對人膽管癌RBE細胞的抑制作用，并證實GL63可有效抑制JAK2和STAT3蛋白的活化（即磷酸化），從而抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡;同時認為，GL63對RBE細胞的增殖具有抑制作用，其機制可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路來介導的。

腫瘤患者預后較差的重要原因是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和遠處轉移，所以降低膽管癌細胞的遷移、侵襲能力是預防其轉移的有效手段。MMP被公認為是能夠在腫瘤細胞侵襲過程中破壞組織屏障細胞外基質的蛋白內切酶[15]。MMP-2和MMP-9表達水平的升高提示腫瘤細胞侵襲能力增強[16]，因此抑制MMP蛋白的表達被認為是預防癌癥轉移的早期靶點[17-18]。本研究通過劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，GL63可以有效地抑制RBE細胞遷移和侵襲。與空白對照組比較，經不同濃度GL63處理后，RBE細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平均顯著降低，且有隨著藥物濃度升高而降低的趨勢。這提示GL63可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達從而抑制RBE細胞的遷移和侵襲。

已有研究表明，不同藥物對JAK2/STAT3信號通路的調節(jié)可通過內源性線粒體途徑誘導細胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡研究中最重要的癌基因之一，在線粒體介導的內源性凋亡通路中起著重要的作用，其包括抑制凋亡蛋白Bcl-2和誘導凋亡蛋白Bax兩大類[20-21]。內源性線粒體途徑是在Bcl-2蛋白家族的調節(jié)下在線粒體水平上啟動的[22]。當外源刺激激活線粒體中的Bcl-2和Bax時，線粒體的膜通透性將發(fā)生變化[23];隨后，線粒體中的Cyt-c大量釋放到細胞質中，進而促使Caspase-9和Caspase-3激活而轉化為活性狀態(tài)（Cleaved-caspases），最終導致細胞凋亡[24]。線粒體通過激活細胞死亡起始因子Caspase-9介導凋亡信號轉導，激活的Caspase-9激活切割執(zhí)行者Caspase-3，然后活化的Caspase-3會裂解聚二磷酸腺苷核糖聚合酶，進而導致細胞凋亡[25]。本研究顯示，GL63處理可以降低RBE細胞中JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平，誘導Bcl-2蛋白表達下調和Bax蛋白表達上調;同時，GL63能升高Cyt-c表達水平，使Pro-caspase-9和Pro-caspase-3蛋白表達下調、Cleaved-caspase-9和Cleaved-caspase-3蛋白表達上調，提示Caspase-9和Caspase-3被激活。這也證明，GL63可同時通過線粒體介導的內源性途徑來誘導RBE細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，GL63能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來實現(xiàn)對人膽管癌RBE細胞增殖、遷移和侵襲的抑制并誘導其發(fā)生凋亡;其具備成為有效治療或預防膽管癌的藥物的潛能。

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（收稿日期：2020-07-30 修回日期：2021-01-10）

（編輯：段思怡）