藏藥二十五味驢血丸的指紋圖譜建立、含量測定及化學(xué)模式識別分析
2021-04-08 02:03:21鐘镥劉川何青秀張靜張藝
中國藥房 2021年4期
鐘镥 劉川 何青秀 張靜 張藝
摘 要 目的：建立藏藥二十五味驢血丸的指紋圖譜，測定其中5種成分的含量，并進行化學(xué)模式識別分析。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。以秦皮乙素為參照，繪制10批藏藥二十五味驢血丸的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰;同時采用相同的HPLC法測定藏藥二十五味驢血丸中5種成分的含量;采用SPSS 19.0軟件進行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：10批藏藥二十五味驢血丸共有11個共有峰，相似度均大于0.98;共指認了秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素和鞣花酸等5個共有峰。秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素、鞣花酸檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為1.232～11.092 μg/mL（r=0.999 6）、2.766～24.893 μg/mL（r=0.999 5）、1.400～12.600 μg/mL（r=0.999 8）、0.600～5.400 μg/mL（r=0.999 5）、49.447～445.025 μg/mL（r=0.999 4）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為101.29%（RSD=2.33%，n=3）、91.39%（RSD=1.22%，n=3）、90.28%（RSD=1.88%，n=3），98.76%（RSD=2.53%，n=3）、101.45%（RSD=2.84%，n=3）、100.44%（RSD=1.38%，n=3），100.91%（RSD=1.73%，n=3）、97.78%（RSD=2.07%，n=3）、99.15%（RSD=1.28%，n=3），100.27%（RSD=1.81%，n=3）、98.38%（RSD=1.89%，n=3）、101.92%（RSD=1.17%，n=3），95.50%（RSD=0.67%，n=3）、99.89%（RSD=0.38%，n=3）、100.10%（RSD=0.65%，n=3）。含量分別為0.175～0.310、0.351～0.632、0.274～0.395、0.186～0.278、6.956～8.636 mg/g。聚類分析結(jié)果顯示，10批藏藥二十五味驢血丸樣品可聚為兩類，其中S1～S4為一類、S5～S10為一類。主成分分析結(jié)果顯示，兩個主成分的累積方差貢獻率為89.178%。結(jié)論：所建指紋圖譜穩(wěn)定、可行，含量測定方法簡便、準確、重復(fù)性好，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于藏藥二十五味驢血丸的質(zhì)量控制。
關(guān)鍵詞 藏藥二十五味驢血丸;高效液相色譜法;指紋圖譜;主成分分析;聚類分析;含量測定
ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills， and determine the contents of 5 components， and to conduct chemical pattern recognition. METHODS： HPLC method was adopted. Using aesculetin as reference， HPLC fingerprint of 10 batches of Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills were drawn. The similarity evaluation was conducted by using Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint Similarity （2012 edition）， and the common peaks were determined. Same HPLC method was adopted to determine the contents of 5 components in Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills. The cluster analysis and principle component analysis were performed by using SPSS 19.0 software. RESULTS： Totally 11 common peaks were calibrated， and the similarity was higher than 0.98. Five common peaks were identified， as aesculetin， orientin， isovitexin， isoscoparin and ellagic acid.? The linear range of aesculetin， orientin， isovitexin， isoscoparin and ellagic acid were 1.232-11.092 μg/mL（r=0.999 6）， 2.766-24.893 μg/mL（r=0.999 5）， 1.400-12.600 μg/mL（r=0.999 8）， 0.600-5.400 μg/mL（r=0.999 5）， 49.447-445.025 μg/mL（r=0.999 4）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2%. The average recoveries were 101.29% （RSD=2.33%，n=3）， 91.39% （RSD=1.22%，n=3）， 90.28% （RSD=1.88%，n=3），98.76% （RSD=2.53%，n=3）， 101.45% （RSD=2.84%，n=3）， 100.44% （RSD=1.38%，n=3） ，100.91% （RSD=1.73%，n=3）， 97.78% （RSD=2.07%，n=3）， 99.15% （RSD=1.28%，n=3） ，100.27% （RSD=1.81%，n=3）， 98.38% （RSD=1.89%，n=3）， 101.92% （RSD=1.17%，n=3） ，95.50% （RSD=0.67%，n=3）， 99.89% （RSD=0.38%，n=3）， 100.10% （RSD=0.65%，n=3）， respectively. Their contents were 0.175-0.310， 0.351-0.632， 0.274-0.395， 0.186-0.278， 6.956-8.636 mg/g， respectively. Cluster analysis showed that 10 batches of Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills were clustered into two category， with S1-S4 as one category and S5-S10 as one category. Principal component analysis showed that accumulative contribution rate of two principle components was 89.178%. CONCLUSIONS： Established fingerprint is stable and feasible， and the method of content determination is simple， accurate and reproducible. They combined with chemical pattern recognition can be used for the quality control of the Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills.
KEYWORDS? ?Tibetan medicine Ershiwuwei luxue pills; HPLC; Fingerprint; Principle component analysis; Cluster analysis;Content determination
藏藥二十五味驢血丸（藏藥名
藏藥二十五味驢血丸由驢血、生等膏、降香、檀香、毛訶子、訶子、余甘子等25味藥材組成，主要含有黃酮類、酚酸類、苯丙素類、生物堿類、多糖類等有效成分[2]。其中，秦皮乙素為苯丙素類成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等活性[4-5];葒草苷、異牡荊素和異金雀花素為黃酮類成分，具有抗炎、保肝、抗氧化、抗腫瘤、保護心臟、保護神經(jīng)等活性[6-9];鞣花酸為酚酸類成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[10]。目前，《衛(wèi)生部藥品標準：藏藥（第1冊）》關(guān)于該藥的質(zhì)量標準中僅收載了以秦皮甲素為對照的薄層鑒別，未見含量測定和指紋圖譜測定項[2]。武嘉庚等[11]對二十五味驢血丸中的西紅花、人工牛黃進行了薄層鑒別，并以大黃酚為指標成分進行了含量測定，雖然為該藥的質(zhì)量控制提供了參考，但指標單一。此外，有研究對二十五味驢血丸中的沒食子酸進行報道[12-13]，但未見其他指標成分的定性定量分析。
指紋圖譜是基于對物質(zhì)群整體作用的認識，借助于波譜或色譜等技術(shù)獲得的中藥化學(xué)成分的波譜或色譜圖，是實現(xiàn)鑒別產(chǎn)品真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可靠手段[14-15]?；瘜W(xué)模式識別技術(shù)可對高效液相色譜（HPLC）等數(shù)據(jù)進行客觀分析，既可對多個指標進行統(tǒng)計分析，又可將整個圖譜信息數(shù)量化，進而使其可以被計算機識別與處理，從而更加客觀地反映中藥的質(zhì)量信息，達到全面控制中藥質(zhì)量的目的[16]。鑒于此，本研究建立了藏藥二十五味驢血丸的HPLC指紋圖譜，測定了秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素和鞣花酸等5個成分的含量，同時結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對該藥進行了分析，旨在為全面控制藏藥二十五味驢血丸的質(zhì)量提供參考。
1 材料
1.1 主要儀器
實驗所用主要儀器有：1260型 HPLC儀（包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Chemistation 04.03色譜工作站，美國Agilent公司）、FA1004型萬分之一分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、BSA124S型十萬分之一分析電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、SB-8200DTS型雙頻超聲儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司，功率400 W，頻率40 kHz）、UPH-I型超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。
1.2 主要藥品與試劑
秦皮乙素對照品（批號110741-201708，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院，葒草苷對照品（批號H-044-181216，純度≥98%）、異牡荊素對照品（批號Y-116-180803，純度≥98%）、異金雀花素對照品（批號Y-077-190517，純度≥98%）、鞣花酸對照品（批號R-004-190812，純度≥98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。
10批藏藥二十五味驢血丸（編號S1～S10，規(guī)格均為每丸重0.25 g）樣品來源信息見表1。
2 方法與結(jié)果
2.1 藏藥二十五味驢血丸HPLC指紋圖譜的建立
2.1.1 供試品溶液的制備 取藏藥二十五味驢血丸適量，研碎，精密稱取粉末（過二號篩），約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別取秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素、鞣花酸對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.105、0.118、0.101、0.106、0.302 mg/mL的混合對照品溶液。
2.1.3 色譜條件 以Chromsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～30 min，25%A→35%A;30～60 min，35%A），檢測波長為350 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。
2.1.4 精密度試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以秦皮乙素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。
2.1.5 重復(fù)性試驗 取藏藥二十五味驢血丸（編號S1）0.5 g，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以秦皮乙素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，分別于室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12、24 h時，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以秦皮乙素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n=8），相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.7 指紋圖譜的建立 取10批藏藥二十五味驢血丸，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，生成指紋圖譜的共有模式，并以此作為對照指紋圖譜（R），同時生成疊加指紋圖譜，詳見圖1、圖2。
2.1.8 相似度評價 將10批藏藥二十五味驢血丸樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價。結(jié)果，10批藏藥二十五味驢血丸樣品的相似度分別為0.999、0.995、0.994、0.998、0.999、0.997、0.994、0.984、0.988、0.983，均大于0.98。這提示，10批藏藥二十五味驢血丸樣品的圖譜與對照指紋圖譜具有較高的相似度，即各批樣品的化學(xué)成分一致性較好。
2.1.9 共有峰的指認 10批藏藥二十五味驢血丸樣品共有11個共有峰，通過與混合對照品溶液的保留時間（按相同色譜條件分析所得，見圖3A）進行對比，共指認出其中5個共有峰，分別為秦皮乙素（5號峰）、葒草苷（8號峰）、異牡荊素（9號峰）、異金雀花素（10號峰）、鞣花酸（11號峰）。由于秦皮乙素含量相對較高、分離度較好，且出峰穩(wěn)定，故以其為參照計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，10批藏藥二十五味驢血丸樣品相對保留時間的RSD為0～0.84%，相對峰面積的RSD為0～67.19%，詳見表2、表3。
2.2 5種有效成分的含量測定
2.2.1 溶液的制備 供試品溶液的制備同“2.1.1”項，混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項。
2.2.2 色譜條件 色譜條件同“2.1.3”項。
2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1）和空白溶液（甲醇）適量，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000，拖尾因子為0.9～1.1，空白溶液對5種成分的測定無干擾，詳見圖3。
2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，加80%甲醇制成秦皮乙素質(zhì)量濃度分別為1.232、2.464、3.697、6.162、8.627、11.092 μg/mL，葒草苷分別為2.766、5.532、8.298、13.829、19.361、24.893 μg/mL，異牡荊素分別為1.400、2.800、4.200、7.000、9.800、12.600 μg/mL，異金雀花素分別為0.600、1.200、1.800、3.000、4.200、5.400 μg/mL，鞣花酸分別為49.447、98.894、148.342、247.236、346.131、445.025 μg/mL的混合系列線性工作溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表4。
2.2.5 精密度試驗 取“2.2.4”項下混合系列線性工作溶液（秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素和鞣花酸的質(zhì)量濃度分別為2.464、5.532、2.800、1.200、98.894 μg/mL）適量，按“2.2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.58%、1.67%、1.86%、1.06%、1.28%（n=6），表明儀器精密度良好。
2.2.6 重復(fù)性試驗 取藏藥二十五味驢血丸樣品（編號S1）0.5 g，共6份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結(jié)果，秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素、鞣花酸含量的RSD分別為1.91%、1.93%、1.76%、1.16%、0.84%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。
2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，分別于室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12、24 h時，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素、鞣花酸峰面積的RSD分別為1.83%、1.61%、1.73%、1.52%、1.38%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的藏藥二十五味驢血丸樣品（編號S1）約0.25 g，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表5。
2.2.9 樣品含量測定 取10批藏藥二十五味驢血丸樣品粉末，每份約0.5 g，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。每樣品平行操作3次，取平均值，結(jié)果見表6。
2.3 聚類分析
以10批藏藥二十五味驢血丸指紋圖譜中測定的5個已指認的共有峰（下同）的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進行分析，以Pearson相關(guān)性為測度，采用組間聯(lián)接法繪制聚類分析圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，10批藏藥二十五味驢血丸樣品可聚為2類，其中S1～S4為一類、S5～S10為一類。
2.4 主成分分析
主成分分析能夠?qū)⒃卸鄠€指標數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成一組若干個新的互不相關(guān)的綜合變量，可用于全面反映多個原始數(shù)據(jù)的信息[17]。以10批藏藥二十五味驢血丸指紋圖譜中的5個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進行主成分分析，以特征值>1的成分為主成分[18-19]。結(jié)果，共提取到2個主成分，累積方差貢獻率為89.178%，表明這2個主成分包含了藏藥二十五味驢血丸的主要信息，達到了降維的目的，其本質(zhì)是一種矩陣變換過程[19]，詳見表7。
以10批藏藥二十五味驢血丸指紋圖譜中的5個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA-P 11.5軟件繪制主成分得分圖。結(jié)果，10批藏藥二十五味驢血丸樣品可以被分為 2 類，其中S1～S4為一類、S5～S10為一類，與“2.3”項下聚類分析結(jié)果一致，詳見圖5。
3 討論
本課題組前期分別對不同提取溶劑（甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇、60%甲醇和60%乙醇）、提取時間（20、30、40、50 min）、提取方式（超聲、回流）、提取溶劑用量（20、30、40、50 mL）的提取效果進行了考察。結(jié)果，以80%乙醇30 mL超聲30 min所得提取物的色譜峰數(shù)量較多且分離效果較好，故選擇這種方式制備供試品溶液。同時，本課題組還考察了不同流動相（甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水）、檢測波長（330、350、370 nm）、色譜柱（Chromsil C18、Kromasil 100-5-C18、Zorbax Eclipse XDB-C18）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、分析時間（45、60、75 min）等的分離效果。結(jié)果，以“2.1.3”項下色譜條件的分離效果較好，且色譜峰數(shù)量較多。
10批藏藥二十五味驢血丸的HPLC 圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.98，表明不同廠家生產(chǎn)的藏藥二十五味驢血丸的化學(xué)成分相似，一致性較好。含量測定結(jié)果顯示，秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素和鞣花酸等5種成分含量的RSD分別為14.77%、20.83%、12.88%、12.40%、7.01%，表明不同廠家的藏藥二十五味驢血丸質(zhì)量存在一定差異，這可能與原藥材基原的多樣性和復(fù)雜性有關(guān)，包括土壤、氣候等自然條件[20-21]。
藏藥二十五味驢血丸的HPLC指紋圖譜共有11個共有峰，經(jīng)與混合對照品比對，指認了其中5個成分，分別為秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、異金雀花素和鞣花酸。聚類分析分析結(jié)果顯示，10批藏藥二十五味驢血丸樣品可聚為2類，其中西藏廠家產(chǎn)樣品聚為一類（S1～S4）、青海廠家產(chǎn)樣品聚為另一類（S5～S10）。主成分分析結(jié)果顯示，2個主成分的累積方差貢獻率為89.178%，同樣聚為兩類，與聚類分析結(jié)果一致。這提示，不同廠家產(chǎn)藏藥二十五味驢血丸含量差異較大，同一地區(qū)廠家的藏藥二十五味驢血丸成分含量相似，這可能與不同廠家所用原藥材的質(zhì)量和儲存方式、時間等有關(guān)[20-21]。除異金雀花素外，秦皮乙素、葒草苷、異牡荊素、鞣花酸均具有抗炎的生物活性，而藏藥二十五味驢血丸具有抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功效，提示這4個成分可能是該藥抗炎作用的有效成分之一，可為下一步的藥理機制研究提供參考。鑒于此，本研究后期將借用DNA條形碼鑒定技術(shù)及核磁共振、紅外光譜等現(xiàn)代化學(xué)鑒定技術(shù)進一步探討。
綜上所述，所建指紋圖譜穩(wěn)定、可行，含量測定方法簡便、準確、重復(fù)性好，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于藏藥二十五味驢血丸的質(zhì)量控制。
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（收稿日期：2020-09-18 修回日期：2020-12-29）
（編輯：陳 宏）
